Спасение рекомбинантный Ньюкасл вирусное заболевание из кДНК

Вируса болезни Ньюкасла (NDV), птичий парамиксовирус, принадлежащая к роду Avulavirus ^1, является экономически актуальны и таким образом широко исследованы и прослушивала зоонозных агент, который может серьезно повлиять на птицеводство по всему миру. Хотя это и не человеческий патоген, НДВ также хорошо изучены за пределы поля ветеринара и как модели парамиксовируса и из-за его высокой интересных, природных онколитических свойств ^6. Исследование NDV большую пользу от развития обратных методов генетики для одноцепочечными, несегментированная отрицательной смысловой РНК вирусов, впервые описанных для вируса бешенства по Конзельманн и Вашии коллегами ^2. Разнообразие генетически модифицированных NDVs, проведение чужеродных генов или модификации их дикого типа генома были широко изучены до сих пор. Работа с этих рекомбинантных вирусов имеет решающее значение для характеристики различных факторов вирулентности не только NDV но и другой соответствующей Хуман патогенов, таких как вируса гриппа А ⁷ – или возникающих Нипах вируса ^8. Кроме того, ряд различных исследований исследовали использование этих методов для улучшения врожденную противоопухолевую активность NDV ^6,9,10, в основном путем повышения иммуностимулирующие свойства вируса. Другая соответствующая область исследований на рекомбинантных NDVs было поколение вакцин-кандидатов против других вирусных заболеваний, таких как грипп ^{5,11,12, 13} ВИЧ кори ^{14, 15} SARS, или что вызвано дыхательных sincytial вируса (RSV) ^16. Среди различных примечательных преимуществ, предоставляемых по NDV являются отсутствие существовавшие ранее иммунитета в человеческих популяциях, стабильность иностранных генетических вставок, отсутствия recombinatory деятельности и общих высоким профилем безопасности в сочетании с вышеупомянутым естественных иммуностимулирующих свойств ^17. Стоит также отметить, потенциальное использование рекомбинантных двухвалентных вакцин в рoultry, защищает от обоих NDV и высокопатогенного гриппа птиц вирусы ^11,12. Это может быть отличным способом, чтобы уменьшить шансы последнего распространяется от дикой к домашним животным, таким образом, также помогает предотвратить возможную межвидовой скачок страшного птичьего гриппа для человека. Наконец, репортер-выражения NDV были использованы для оценки врожденных иммунных реакций, а также идентификации интерферона антагониста, кодируемого нескольких вирусов ^18-27.

Спасение процесс рекомбинантной несегментированная, вирус отрицательной мель РНК в основном состоит на искусственно заставляя вирусную цикл репликации в производящей клетки путем трансфекции кДНК, кодирующей минимальный инфекционный молекулярные машины, известной как рибонуклеопротеидных или RNP (рис. 2). В RNPs состоять из вирусной полимеразы (P и L белков), нуклеопротеина (NP) и полной длины антигеномного РНК вируса. Эта РНК + antigenome-йэ шаблон необходим для генерации дополнительных РНК-геномов, которые, также связанных с остальной частью белков вирусной RNP, повторяет тот же инфекционный комплекс, который естественным вирус бы выпустить на цитоплазме клетки при инфекции (рис. 2А ). От этого шага года, вирусная цикл может продолжаться естественным и рекомбинантные вирионы, encapsidating измененные геномы, будет генерироваться (рис. 2б). Примечательно, что трансфекции геномной кДНК вместо антигеномного кДНК значительно ухудшает или полностью отменяет эффективности спасательных ^2,28-30. Даже когда антигеномного кДНК трансфицируют, эффективность капсидировани рекомбинантного РНК в РНП в трансфицированных клетках, вероятно, очень низка. Из-за этого, спасательные протоколы для NDV часто включают в себя различные шаги для амплификации нескольких вирусных частиц, выпущенных из первоначально трансфицированных клеток на сокультивировани их разрешающих клеток и / илиинфекция в яйцах с зародышем.

До спасения, кДНК можно манипулировать с помощью стандартных процедур клонирования в целях получения желаемых изменений. Хотя конкретные мутации различных генных продуктов и регуляторных последовательностей вируса может быть прямо достигается таким образом, многие из опубликованных работ с участием рекомбинантных NDV потребовало добавление нового единицы транскрипции в геном NDV. Как и другие члены семейства парамиксовирусов, геном НДВ кодирует восемь различных белков в шести транскрипционных единиц, которые по-разному выраженных в зависимости от их местонахождения относительно 3 'конца в убывающей градиентом критической для жизненного цикла вируса ^1. Из-за этого, расположение нового транскрипционной единицы внутри генома должны быть тщательно подобраны, чтобы достичь баланса между экспрессии трансгена и ухудшение вирусной репликации. Вносимые между Р и М генов был использован самый, тHough другие сайты также были протестированы ^13,31.

Какой бы ни была вставка, клонирование в НДВ кДНК необходимо следовать некоторым правилам, чтобы генерировать rescuable конструкцию: (I) любой новый ген, которые будут включены в геном NDV должен находиться под контролем соответствующих сигналов для вирусной РНК-зависимой РНК полимеразы. Эти последовательности должны быть добавлены перед новой открытой рамки считывания (ORF), так полимераза может распознать конец предыдущей гена (GE) и началом нового трансгена (GS), расположенных на одной нуклеотидной межгенной последовательности (Ig) . Добавление действительного Козак (К) последовательности, чтобы улучшить эукариотической перевод рибосомальную также рекомендуется для лучшего выражения инородного белка ^32; (II) эффективное тиражирование NDV, как и для большинства членов семьи Paramyxoviridae, зависит от длины генома быть кратна шесть ^33, поэтому любая вставка в NDV должен следовать этому "правилу шести". При необходимости REQuired дополнительные нуклеотиды могут быть добавлены по потоку новый ORF, и (III) последовательность трансген должен быть проверен, чтобы найти можно GE и GS, такие как последовательности, которые могут ухудшить эффективность спасательных, экспрессию трансгена и / или вирусов жизнеспособность. Если присутствуют, эти последовательности должны быть удалены немого мутагенеза. Генерация рекомбинантного кДНК полной длины следующей вышеупомянутые правила является первым шагом для того, чтобы эффективно производить генетически модифицированного NDV как подробно здесь.

В системе все конструкции ДНК находятся под контролем полимеразы Т7 РНК промотора (рис. 3). Это цитоплазматический полимеразы приведена в транс по ко-инфекции с рекомбинантным модифицированного вируса коровьей оспы Анкара (MVA-Т7) ^34. Фиг.3А показывает pNDV-B1 плазмиду, кодирующую полноразмерную кДНК антигеномного ^5. Фиг.3В показывает Ptm1 плазмидами, кодирующими NP, P и L ОРС. Плазмиды pCITE-GFP, который кодирует, UNDER промотор Т7, зеленый флуоресцентный белок (GFP), и pCAGGs GFP ^18, который кодирует ту же самую ORF под курица бета промотор актина ^35, используют в качестве контрольной группы. В этом протоколе мы покажем процедуру, чтобы спасти рекомбинантный NDV из кДНК со сниженной вирулентностью НДВ штамм Hitchner B1 ⁵ (рис. 4).