Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Virus della malattia di Newcastle (NDV), un paramyxovirus aviario appartenente al genere Avulavirus ^1, è un agente di zoonosi economicamente rilevante e quindi ampiamente studiato e sorvegliato, che può influenzare fortemente l'allevamento di pollame in tutto il mondo. Pur non essendo un agente patogeno umano, NDV è stato anche studiato a fondo al di là del campo veterinario sia come modello paramyxovirus e grazie alle sue molto interessanti, proprietà naturali oncolitici ^6. Ricerca su NDV notevolmente beneficiato lo sviluppo di tecniche di genetica inversa per, non segmentati virus a singolo filamento di RNA negativo-senso, in primo luogo descritti per virus della rabbia da Conzelmann e coleagues ^2. Una varietà di NDVs geneticamente modificati, portatori di geni estranei o modifiche del loro tipo selvatico genoma sono stati ampiamente studiati da allora. Lavorare con questi virus ricombinanti è stato fondamentale per individuare i diversi fattori di virulenza non solo di NDV, ma anche di altri huma pertinenten agenti patogeni come virus dell'influenza A ⁷ – o l'emergente Nipah virus ^8. Inoltre, diversi studi hanno esplorato l'uso di queste tecniche per migliorare l'attività antitumorale innata NDV ^6,9,10, soprattutto migliorando le proprietà immunostimolanti del virus. Altro settore di ricerca sulla NDVs ricombinanti è stata la generazione di candidati vaccini contro altre malattie virali come l'influenza ^{5,11,12, 13} HIV, morbillo ^14, SARS ^15, o che ha causato dal virus sincytial respiratorio (RSV) ^16. Tra i vari notevoli vantaggi forniti dal NDV sono la mancanza di immunità preesistente nella popolazione umana, la stabilità degli inserti estere genetiche, una mancanza di attività recombinatory e nel complesso un elevato profilo di sicurezza combinato con le suddette proprietà immunostimolanti naturali ^17. E 'inoltre degno di nota il potenziale uso di vaccini bivalenti ricombinanti in poultry, l'influenza aviaria di protezione contro sia NDV e altamente patogeno virus ^11,12. Questo può essere un ottimo modo per diminuire le probabilità di quest'ultimo diffusione da selvatici animali domestici, quindi anche aiutando a prevenire un eventuale salto inter-specifica della temuta influenza aviaria agli esseri umani. Infine, sono stati utilizzati reporter esprimere NDV per la valutazione della risposta immunitaria innata come pure l'identificazione di interferone antagonista codificata dal virus multipli ^18-27.

Il processo di salvataggio di un ricombinante, non segmentato, virus RNA negativo filamento costituito essenzialmente da forzare artificialmente un ciclo di replicazione virale in una cellula che produce trasfettando cDNA codificanti il macchinario molecolare minimo infettiva, noto come ribonucleoproteina o RNP (Figura 2). Le RNP consistono polimerasi virale (P e proteine ​​L), la nucleoproteina (NP) e l'intera lunghezza antigenomic RNA del virus. Questo RNA + antigenome è ªe modello richiesto per la generazione dei genomi RNA complementari, che, associati anche con il resto delle proteine ​​della RNP virale, ricapitola stesso complesso infettiva che un virus naturale libererebbe il citoplasma della cellula dopo l'infezione (Figura 2A ). Da questo punto in poi, il ciclo virale può procedere in modo naturale e virioni ricombinanti, encapsidating i genomi modificati, verrà generato (Figura 2B). Sorprendentemente, trasfezione del cDNA genomico invece del cDNA antigenomic compromette notevolmente o abolisce efficienza salvataggio ^2,28-30 completamente. Anche quando cDNA antigenomic viene trasfettato, l'efficienza del incapsidamento del RNA ricombinante in RNPs in cellule trasfettate è probabilmente molto bassa. A causa di questo, protocolli di salvataggio per NDV spesso includono diversi passaggi per l'amplificazione delle particelle virali pochi rilasciate dalle cellule trasfettate originariamente da essi coculturing con cellule permissive e / o dalinfezione di uova embrionate.

Prima del salvataggio, il cDNA può essere manipolato da procedure di clonazione standard per generare le modifiche desiderate. Mentre mutazioni specifiche dei diversi prodotti genici e sequenze regolatrici del virus possono essere direttamente raggiunti in questo modo, molti dei lavori pubblicati coinvolge ricombinante NDV ha richiesto l'aggiunta di una nuova unità trascrizionale nel genoma NDV. Come altri membri della famiglia paramyxovirus, il genoma NDV codifica otto proteine ​​differenti in sei unità trascrizionali, che sono differenzialmente espressi in funzione della loro posizione rispetto alla estremità 3 'in un gradiente critico per il ciclo di vita virale ¹ discendente. A causa di questo, la posizione della nuova unità trascrizionale all'interno del genoma va scelto opportunamente per raggiungere un equilibrio tra l'espressione del transgene e compromissione della replicazione virale. Inserimento tra P e M geni è stato usato più, tHough altri siti sono stati anche testati ^13,31.

Qualunque sia l'inserto, la clonazione in NDV cDNA deve seguire alcune regole per generare un costrutto salvabile: (i) qualsiasi nuovo gene da inserire nel genoma NDV deve essere sotto il controllo dei segnali appropriati per il virale RNA-dipendente-RNA polimerasi. Queste sequenze devono essere aggiunti a monte della nuova fase di lettura aperta (ORF) per la polimerasi possono riconoscere la fine del gene precedente (GE) e l'inizio del nuovo transgene (GS), distanziati di un singolo nucleotide sequenza intergenica (IG) . Aggiunta di un valido Kozak (K) sequenza di migliorare traduzione eucariotico ribosomiale è consigliato anche per una migliore espressione proteina estranea ^32; (ii) replica efficiente di NDV, come per la maggior parte dei membri della famiglia Paramyxoviridae, dipende dalla lunghezza del genoma essere multiplo di sei ^33, pertanto, qualsiasi inserimento nella NDV deve seguire questa "regola del sei". Se necessario, required nucleotidi possono essere aggiunti a valle della nuova ORF, e (iii) la sequenza del transgene dovrebbe essere controllata per trovare possibili GE e GS come sequenze che potrebbero compromettere l'efficienza di salvataggio, l'espressione del transgene e / o vitalità del virus. Se presente, queste sequenze devono essere rimossi mediante mutagenesi silenzioso. La generazione di cDNA ricombinante piena lunghezza seguenti norme suddette è il primo passo per produrre efficientemente un NDV geneticamente modificato come qui descritto.

Nel sistema tutti i costrutti di DNA sono sotto il controllo del promotore T7 RNA polimerasi (Figura 3). Questa polimerasi citoplasmatica è fornito in trans da coinfezione con un modificato vaccinia virus ricombinante Ankara (MVA-T7) ^34. Figura 3A mostra il plasmide pNDV-B1, che codifica l'intera lunghezza cDNA antigenomic ^5. Figura 3B mostra plasmidi codificanti pTM1 NP, P e L ORF. Plasmidi pCITE-GFP, che codifica, under il promotore T7, la proteina fluorescente verde (GFP), e pCAGGS GFP ^18, che codifica lo stesso ORF sotto il promotore actina di pollo beta ^35, sono usati come controlli. In questo protocollo mostriamo la procedura per salvare ricombinante NDV dal cDNA del lentogeno NDV ceppo Hitchner B1 ⁵ (Figura 4).