Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Newcastle Disease Virus (NDV), een aviaire paramyxovirus die behoren tot het genus Avulavirus ^1, is een economisch relevant en dus op grote schaal onderzocht en bewaakt zoönoseverwekker, die ernstig kan beïnvloeden pluimveehouderij over de hele wereld. Hoewel het niet een menselijk pathogeen, NDV is ook grondig bestudeerd buiten het veld dierenarts zowel als model paramyxovirus en vanwege zijn zeer interessant, natuurlijke oncolytic eigenschappen ^6. Onderzoek naar NDV sterk geprofiteerd van de ontwikkeling van reverse genetics technieken voor enkelstrengs, niet-gesegmenteerde negatieve-sense RNA-virussen, voor het eerst beschreven voor hondsdolheid virus door Conzelmann en coleagues ^2. Een verscheidenheid van genetisch gemodificeerde NDVs, dragen vreemde genen of aanpassingen van hun wild-type genoom zijn uitgebreid bestudeerd sinds die tijd. Werken met deze recombinante virussen is cruciaal geweest om verschillende virulentiefactoren karakteriseren niet alleen van NDV, maar ook van andere relevante human ziekteverwekkers zoals influenza A virus ⁷ – of de opkomende Nipah virus ^8. Voorts zijn verschillende studies het gebruik van deze technieken voor de aangeboren antitumorale activiteit van NDV ^6,9,10 verbeteren, meestal door het verbeteren van de immunostimulerende eigenschappen van het virus onderzocht. Andere betrokken onderzoeksgebied op recombinante NDVs heeft de generatie van kandidaat-vaccins tegen andere virale ziekten zoals influenza geweest ^{5,11,12, 13} HIV, mazelen ^14, SARS ¹⁵ of dat door de respiratoire sincytial virus (RSV) ^16. Tussen de verschillende opmerkelijke voordelen van NDV zijn het gebrek aan reeds bestaande immuniteit in humane populaties, de stabiliteit van het vreemde genetische inserts, weinig recombinatory activiteit en de hoge veiligheidsprofiel combinatie met de bovengenoemde natuurlijke immunostimulerende eigenschappen ^17. Opvallend is ook het potentiële gebruik van recombinant bivalente vaccins in poultry, beschermend tegen zowel NDV en hoogpathogene aviaire influenza virussen ^11,12. Dit kan een uitstekende manier om de kansen van de laatste verspreiding van wilde naar gedomesticeerde dieren, ook als bijdrage aan een mogelijke inter-specifieke sprong van de gevreesde vogelgriep bij de mens te voorkomen te verminderen zijn. Ten slotte heeft reporter expressie NDV gebruikt voor de evaluatie van aangeboren immuunresponsen evenals de identificatie van interferon antagonist gecodeerd door meerdere virussen ^18-27.

Het proces van terugwinning van een recombinant, niet-gesegmenteerde negatieve RNA virus bestaat hoofdzakelijk op kunstmatig dwingen een virale replicatiecyclus in een producerende cel door transfectie van cDNA dat codeert voor de minimale infectieuze moleculaire machinerie, bekend als ribonucleoproteïne of RNP (figuur 2). De RNP's bestaan ​​uit het virale polymerase (P en L eiwitten), de nucleoproteïne (NP) en de volledige lengte antigenoom RNA van het virus. Dit RNA + antigenoom the template nodig voor het genereren van de complementaire RNA-genomen, die ook samen met de rest van de eiwitten van het virale RNP, recapituleert hetzelfde infectieuze complex dat een natuurlijk virus zou vrijgeven aan het cytoplasma van de cel na infectie (Figuur 2A ). Vanaf deze stap verder, kan de virale cyclus natuurlijk doorgaan en recombinante virions, inkapselen de gemodificeerde genomen, worden gegenereerd (Figuur 2B). Opmerkelijk, transfectie van de genomische cDNA in plaats van het antigenome cDNA sterk vermindert of volledig afschaft redding efficiëntie ^2,28-30. Zelfs wanneer antigenome cDNA getransfecteerd, de efficiëntie van de inkapseling van recombinante RNA in RNP's in getransfecteerde cellen is waarschijnlijk erg laag. Hierdoor redding protocollen voor NDV bevatten vaak verschillende stappen voor de amplificatie van het aantal virale deeltjes die vrijkomen uit de oorspronkelijk getransfecteerde cellen door coculturing hen permissieve cellen en / of deinfectie van bebroede eieren.

Vóór de redding, kan het cDNA worden gemanipuleerd met standaard kloneringswerkwijzen om de gewenste wijzigingen genereren. Hoewel specifieke mutaties van de verschillende genproducten en regulerende sequenties van het virus onomwonden worden bereikt Zo veel gepubliceerde werk recombinant NDV is de toevoeging van een nieuwe transcriptie-eenheid vereist in het NDV genoom. Net als andere leden van de familie paramyxovirus, het NDV-genoom codeert acht verschillende eiwitten in zes transcriptionele eenheden die differentieel uitgedrukt afhankelijk van hun locatie ten opzichte van het 3'-uiteinde in een dalende helling kritiek voor de virale levenscyclus ^1. Hierdoor moet de locatie van de nieuwe transcriptie-eenheid in het genoom zorgvuldig worden gekozen om een ​​evenwicht tussen expressie van het transgen en aantasting van virale replicatie te bereiken. Insertie van P en M-genen is het meest gebruikt, though andere sites zijn ook getest ^13,31.

Ongeacht het inzetstuk, het klonen in NDV-cDNA moet een aantal regels om een ​​rescuable construct gegenereerd: (i) nieuwe gen worden opgenomen in de NDV-genoom onder controle van de geschikte signalen voor het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase. Deze sequenties moeten stroomopwaarts van de nieuwe open leesraam (ORF) worden toegevoegd zodat de polymerase kan het einde van de vorige gen (GE) en het begin van de nieuwe transgen (GS) herkent, gescheiden door een nucleotide sequentie intergene (IG) . Toevoeging van een geldige Kozak (K) sequentie eukaryotische ribosomale translatie verbeteren wordt ook aanbevolen voor een betere vreemde eiwit expressie ^32, (ii) de efficiënte replicatie van NDV, zoals voor de meeste leden van de familie Paramyxoviridae, is afhankelijk van de lengte genoom wordt veelvoud zes ^33, daarom elke inbrengen in de NDV heeft deze "regel van zes" te volgen. Eventueel required extra nucleotiden kunnen stroomafwaarts worden toegevoegd de nieuwe ORF, en (iii) de volgorde van de transgen moet worden gecontroleerd om te vinden mogelijke GE en GS achtige sequenties die redding efficiëntie, transgene expressie en / of levensvatbaarheid virus zou kunnen schaden. Indien aanwezig moet deze sequenties worden verwijderd door stille mutagenese. Het genereren van recombinant volledige lengte cDNA volgende genoemde regels is de eerste stap om efficiënt produceren genetisch gemodificeerde NDV zoals hier beschreven.

In het systeem alle DNA constructen onder controle van de T7 RNA polymerase promoter (Figuur 3). Deze cytoplasmatische polymerase in trans door co-infectie met een recombinant gemodificeerd Vaccinia Ankara virus (MVA-T7) ^34. Figuur 3A tonen de pNDV-B1 plasmide, dat de volledige lengte antigenome cDNA ⁵ codeert. Figuur 3B toont pTM1 plasmiden die NP, P en L ORF. Plasmiden pCITE-GFP, dat codeert, under de T7-promoter, het Green Fluorescent Protein (GFP) en pCAGGS GFP ^18, die dezelfde ORF codeert onder de kippen beta-actine promotor ^35, worden gebruikt als controles. In dit protocol tonen we de procedure te redden recombinant NDV uit het cDNA van de lentogene NDV-stam Hitchner B1 ⁵ (figuur 4).