Анализы для идентификации новых видов Antivirals против вируса катаральной лихорадки овец
Summary
Три анализы, в том числе цитопатического эффекта (CPE) на основе анализа, доза-реакция для анализа и Время-дополнение (ToA) анализа были разработаны, оптимизированы, проверены и использованы для идентификации новых противовирусных препаратов против вируса синего языка (BTV), а также как определить возможный механизм-о-Action (MOA) для вновь выявленных противовирусных препаратов.
Abstract
Для выявления потенциальных противовирусных препаратов против BTV, мы разработали, оптимизированы и проверены три анализов, представленные здесь. CPE на основе анализа был первый анализ, разработанный для оценки соединение показало ли какие-либо противовирусную эффективность и были использованы для скрининга большой библиотеки соединений. Между тем, цитотоксичность противовирусных препаратов могут быть также оценивали с помощью CPE на основе анализа. Анализ доза-реакция была разработана, чтобы определить диапазон эффективности для выбранного антивирусного, т.е. 50% ингибирующей концентрации (IC 50) или эффективную концентрацию (ЕС 50), а также свой ассортимент цитотоксичности (CC 50). Тоа анализ был использован для первоначального исследования МСХ, чтобы определить основной механизм романа противовирусных препаратов во время BTV вирусной жизненного цикла или возможного влияния на хозяина сотового оборудования. Эти анализы являются жизненно важными для оценки противовирусной эффективности в системе культуры клеток, и были использованы для наших недавних исследований, проведенныхING к идентификации ряда новых противовирусных препаратов против BTV.
Introduction
BTV является прототипом двухцепочечной РНК вируса в род Orbivirus, семейного Reoviridae. BTV является одним из наиболее важных заболеваний домашнего скота, в том числе овец, коз, крупного рогатого скота и других домашних животных, с потерей $ 3 млрд / год по всему миру 1,2. Экзотический BTV серотип является важным патогеном животных перечислены в "Министерство сельского хозяйства США повышенной животноводства патогенов." В последнее время вновь возникающие из BTV вызвало серьезную вспышку болезни у крупного рогатого скота и овец в ряде стран по всему Северной Европы 3,4. В результате его экономической значимости и в качестве модельной системы, BTV была предметом обширных молекулярных, генетических и структурных исследований, а также несколько вакцины были разработаны. Однако в связи с отсутствием надлежащих анализов для противовирусной лекарственных препаратов, нет противовирусных препаратов, доступных на BTV.
В недавнем скрининга высокой пропускной (HTS) кампании с использованием BTV как модельной системы, мы гeveloped, оптимизированы и проверены на CPE основе анализа для выявления потенциальных противовирусных препаратов широкого спектра действия против арбовирусы 5. CPE на основе анализа является хорошо известным анализ, который был использован в противовирусной лекарственных препаратов против ряда вирусов, индуцированного быстрое и наблюдаемый CPE / апоптоз 5-7. В нашей системе сообщение BTV инфекция, CPE проявляется в клетках позвоночных, в том числе HeLa, BSR, и НЕК 293Т 8. BTV-индуцированной CPE может контролироваться и количественно, используя различные методы обнаружения жизнеспособность клеток, в том числе жизнеспособность клеток Набор реагентов CellTiter Glo (КТГ комплекте) 9. Этот набор определяет количество жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного клеточного АТФ представлены, который сигнализирует о наличии метаболически активных живых клеток. В оптимальных условиях, СРЕ основе анализа представленных здесь показала свою целесообразность с "смешивать и измерения" один шаг протокола, и гибкости с устойчивых сигналов люминесцентных. Между тем, токсичные соединения РедуCing жизнеспособность клеток будут исключены в этом CPE основе анализа. CPE основе Анализ показал свою устойчивость и надежность для противовирусной лекарственных препаратов против BTV, и был использован для скрининга NIH Молекулярные Библиотеки маленькая молекула Repository (MLSMR), что приводит к идентификации шести нового кластера потенциальной противовирусной ведущего компонента (ов ) 5.
Когда потенциальный противовирусное соединение было идентифицировано с помощью CPE основе анализа, он должен быть подвергнут десятилетнего концентрации доза-реакция анализа, чтобы определить диапазон противовирусной эффективности и цитотоксичность 2. Противовирусная эффективность, представлены как 50% ингибирующую концентрацию (IC 50) или 50% эффективной концентрации (ЕС50), концентрация лекарственного средства, которая ингибирует вирус-индуцированной CPE на полпути между базовой линией и максимума. Цитотоксичность противовирусных препаратов, то есть 50% концентрации цитотоксичности (CC 50), представляет собой концентрациюпрепарата, вызывающего 50% цитотоксичности между базовой и максимумом. Селективный показатель (SI), обозначается как 50% Si (SI 50) вычисляется из CC 50 / IC 50, которая определяет специфичность противовирусное против индуцированного вирусом CPE. IC 50 (или EC 50), CC 50 и SI 50 значения являются критическими меры, чтобы определить, является ли противовирусное соединение является мощным и селективным для дальнейшего развития наркотиков.
Когда противовирусный не показали явной токсичности в пробирке, но предотвратить вирус индуцированных CPE и продуктивной вирусной жизненного цикла, важно, чтобы характеризовать его МСХ 2. Мы инициировали такую характеристику путем проведения Тоа анализа для определения возможного шаг (ы) вирусного жизненного цикла, которая зависит от противовирусного. Как правило, противовирусное соединение добавляют к клеткам в различные моменты времени предварительно или после вирусной инфекции. Если противовирусные были добавлены к инфицированных клеток прикреплять к своей цели сТЭФ в ходе инфекции, было бы привести к снижению активности по сравнению с той, которая была добавлена перед стадией. Таким образом, ToA исследование является критическим для определения противовирусной эффективности соединения, и его потенциальную цель, либо на вирусного жизненного цикла или в хост-машин, участвующих в вирусной жизненного цикла.
Для всех трех анализах, жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CTG следующие инструкции производителя 5. Это система обнаружения выводит адекватные сигналы люминесценции, которые могут быть проанализированы с помощью различного программного обеспечения в доме. Каждый анализ проверены и выполнены по крайней мере, в трех экземплярах с восемью копиями. Для всех полученных данных, три параметра, в том числе среднего значения (AVE), стандартное отклонение (отклонение), и коэффициент вариации (CV) были проанализированы, чтобы определить надежность анализа. После того, надежность анализа было определено, данные будут проанализированы и нанесены с использованием различных biostatics и графическигрн инструменты 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для первоначальной идентификации противовирусных хитов, одним из ключевых шагов для противовирусной открытия и разработки лекарственных является разработка надежных анализов, которые включает в себя выбор количественные маркер, разработки простой протокол, получения достаточных с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан грантом 1R03MH08127-01 и 7R03MH08127-02 от NIH к Q. Ли, и в результате воздействия средств из Отдела Медицины на UAB, чтобы Q. Ли. Поддержка со стороны Molette фонда и Auburn University ценится. Мы также благодарим технические помощь за г-жой Пулин Че и г-н Владимир Musiienko в ходе работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
References
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
- Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
- Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
- Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
- Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
- Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
- Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
- Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
- Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
- Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
- Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
- Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
- Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
- Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
- Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
- Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
- Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).
