Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus
Summary
Drei Assays, einschließlich des zytopathischen Effekts (CPE)-basierte Assays, Dosis-Wirkungs-Assay und Time-of-Addition (TOA)-Assay entwickelt, optimiert, validiert und genutzt, um neue antivirale Mittel gegen Blauzungenvirus (BTV) zu identifizieren, sowie um den möglichen Mechanismus-of-Aktion (MoA) für neu identifizierten antiviralen Medikamenten zu bestimmen.
Abstract
Um mögliche Virostatika gegen BTV zu identifizieren, haben wir entwickelt, optimiert und validiert drei Assays hier vorgestellt. Die CPE-basierte Test war der erste Test entwickelt, um zu beurteilen, ob eine Verbindung zeigte keine antivirale Wirksamkeit und wurden verwendet, um Bildschirm großen Substanzbibliothek. Inzwischen konnte die Zytotoxizität von Virostatika auch mit dem CPE-basierte Assays ausgewertet werden. Die Dosis-Wirkungs-Assay wurde entwickelt, um den Bereich der Wirksamkeit für die ausgewählte antivirale bestimmen, dh 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder effektive Konzentration (EC 50), sowie dessen Bereich der Zytotoxizität (CC 50). Die Toa-Assay wurde für die erste Studie MoA den zugrundeliegenden Mechanismus der neuen antiviralen Medikamenten während der BTV viralen Lebenszyklus oder der möglichen Auswirkungen auf die Wirtszellmaschinerie bestimmen, beschäftigt. Diese Assays sind entscheidend für die Bewertung der antiviralen Wirksamkeit in Zellkultursystem, und sind für unsere jüngsten Forschungen führen verwendetten zur Identifizierung einer Reihe von neuen antiviralen Medikamenten gegen BTV.
Introduction
BTV ist ein Prototyp Doppelstrang-RNA-Virus aus der Gattung Orbivirus, Familie Reoviridae. BTV ist eine der wichtigsten Krankheiten von Haustieren, darunter Schafe, Ziegen, Rinder und andere Haustiere, 3 Milliarden $ / Jahr weltweit 1,2 Verlust. Die exotische BTV-Serotyp ist ein in den aufgeführten wichtig Tierpathogen "USDA Hohe Consequence Tierkrankheitserreger." Vor kurzem hat die wieder auftauchende der BTV hat einen großen Ausbruch der Krankheit bei Rindern und Schafen in mehreren Ländern in Nordeuropa 3,4 verursacht. Als Ergebnis ihrer wirtschaftlichen Bedeutung und als Modellsystem hat BTV Gegenstand von umfangreichen Molekular, genetische und strukturelle Untersuchungen und mehrere Impfstoffe entwickelt worden. Aufgrund des Mangels an richtigen Tests für antivirale Wirkstoffforschung, es gibt keine antivirale Verfügung gegen BTV.
In einer aktuellen Hochdurchsatz-Screening (HTS)-Kampagne mit BTV als Modellsystem, wir dntwickelt, optimiert und validiert eine CPE-basierte Assays, um potenzielle Breitspektrum antiviralen Medikamenten gegen Arboviren 5 identifizieren. CPE-basierten Assays ist ein anerkannter Test, der in der antiviralen Arzneimittelforschung gegen eine Anzahl von Viren, die eine schnelle und beobachtbaren CPE / Apoptose induziert 5-7 verwendet wurde. In unserem System, Post BTV-Infektion ist CPE in Zellen von Wirbeltieren, einschließlich HeLa, BSR und HEK 293T-8 deutlich. BTV-induzierten CPE überwacht werden könnte und quantifiziert anhand verschiedener Zelllebensfähigkeit Nachweismethoden, einschließlich der CellTiter Glo Lebensfähigkeit der Zellen Reagenzien-Kit (CTG-Kit) 9. Dieses Kit bestimmt die Anzahl der lebensfähigen Zellen in Kultur, die auf die Quantifizierung der zellulären ATP dargestellt, die das Vorhandensein von lebenden Zellen metabolisch aktiv signalisiert. Unter optimierten Bedingungen, die CPE-basierte Assays hier präsentiert werden, zeigen die Machbarkeit mit dem "Mix und messen" ein Schritt-Protokoll und Flexibilität mit stabilen Leuchtsignalen. Inzwischen toxische Verbindungen reduCING Zelllebensfähigkeit wird in dieser CPE-basierte Assays ausgeschlossen. Die CPE-basierte Assay zeigte seiner Robustheit und Zuverlässigkeit für die antivirale Medikamentenforschung gegen BTV, und wurde verwendet, um die NIH Molecular Libraries Small Molecule Repository (MLSMR), die auf die Identifizierung von sechs neuartige antivirale Potential Cluster von Blei-Verbindung (en führt zu screenen ) 5.
Wenn ein potentieller antivirale Verbindung wurde unter Verwendung des CPE-basierten Assay identifiziert wird, muss sie auf die zehn-Konzentration Dosis-Wirkungs-Assay unterzogen werden, um das Spektrum der antiviralen Wirksamkeit und Zytotoxizität 2 zu bestimmen. Die antivirale Wirksamkeit als die 50% inhibitorische Konzentration (IC 50) oder 50% effektive Konzentration (EC 50) dargestellt ist, ist die Konzentration eines Arzneimittels, die virusinduzierte CPE auf halbem Weg zwischen der Grundlinie und Maximal hemmt. Die Zytotoxizität der Virostatika, also die 50% Cytotoxizität Konzentration (CC 50), ist die KonzentrationInduzieren eines Arzneimittels 50% Zytotoxizität zwischen der Grundlinie und Maximum. Der Auswahlindex (SI), 50% SI (SI 50) bezeichnet wird, von CC 50 / IC-50, die die Spezifität der antiviralen gegen Virus-induzierten CPE bestimmt, berechnet. Der IC 50 (oder 50 EG), sind CC 50 und SI 50 Werte kritisch Maßnahmen zu bestimmen, ob eine antivirale Verbindung potenter und selektiver für die weitere Entwicklung von Medikamenten ist.
Wenn ein antivirales zeigte keine offensichtliche Toxizität in vitro, noch verhindert Virus-induzierten CPE und die produktive viralen Lebenszyklus, ist es wichtig, seine MoA 2 charakterisieren. Leiteten solche Charakterisierung durch Ausführen ToA Assay, um die möglichen Schritt (e) des viralen Lebenszyklus, die durch das antivirale betroffen bestimmen. Im allgemeinen wurden antiviralen Verbindung, um Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach der Virusinfektion zugegeben. Wenn die antiviralen Medikamenten wurden in die infizierten Zellen aufgenommen, um sein Ziel zu posten sTEP im Verlauf der Infektion, wäre es in niedriger Aktivität führen, verglichen mit der, die vor dem Schritt zugegeben wurde. Somit ist ToA Studie kritisch für die Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit der Verbindungen und ihrer potentiellen Ziel entweder auf dem viralen Lebenszyklus oder dem Hostmaschinen im viralen Lebenszyklus beteiligt.
Für alle drei Tests wurde die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung der CTG-Kit folgende Herstellerangaben 5 bestimmt. Dieses Erfassungssystem gibt ausreichend Lumineszenz-Signale, die mit Hilfe verschiedener Inhouse-Software analysiert werden konnte. Jeder Test wurde mindestens in dreifacher Ausfertigung mit acht Repliken validiert und durchgeführt. Für alle erhaltenen Daten wurden drei Parameter, einschließlich der Mittelwert (AVE), Standardabweichung (STDEV) und Variationskoeffizient (CV) analysiert, um die Robustheit des Assays zu bestimmen. Sobald die Robustheit des Assays bestimmt wurde, werden die Daten weiter analysiert und mit verschiedenen Biostatik aufgetragen und grafisch werdenWerkzeuge 2 c.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die erstmalige Identifizierung von antiviralen Hits, ist einer der wichtigsten Schritte für die antivirale Wirkstoffforschung und Entwicklung, um robuste Tests zu entwickeln, die die Auswahl eines quantifizierbaren Marker, die Entwicklung einer einfachen Protokoll, ausreichende Signale und weniger als 10% CV enthält. Die meisten biochemischen und zellbasierte Bildschirme sind für eine chemische Ausgangspunkt auf der Grundlage der robustesten, einfache und kostengünstige Assay aufgrund der erforderlichen Reprodu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde durch Gewährung 1R03MH08127-01 und-02 7R03MH08127 von NIH Q. Li unterstützt und von den Mitteln aus IMPACT Abteilung für Medizin an der UAB Q. Li. Unterstützung aus der Molette Fonds und der Auburn University wird geschätzt. Wir danken auch die technischen Hilfestellungen von Frau Pulin Che und Herr Volodymyr Musiienko im Laufe der Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM medium | Gibco | 1134218 | For cell culture |
| FBS | Gibco | 16000044 | For cell culture |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | For cell culture |
| DPBS | Gbico | 1049769 | For cell culture |
| CellTiter-Glo (CTG) kit | Promega | TB288 | For cell viability measurement |
| 70% ethanol | Fisher | S25309B | Diluted from 95% |
| Antiviral huashilcompounds | NIH MLSMR and de novo synthesis | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR cell | Developed in house | ||
| Synergy-II multi-mode microplate reader | BioTek | For luminescent signal reading | |
| MicroFlo select dispenser | BioTek | Adding cells, virus, and reagents | |
| 384-well flat-bottom microplate | CORNING | 28908031 | For cell culture |
| Gen. 5 software | BioTek | For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Version 5 | For biostatic analysis and plot |
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