Summary

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

Published: October 11, 2013
doi:

Summary

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

Abstract

לזהות antivirals הפוטנציאלי נגד BTV, פיתחנו, מותאם ומאומתים שלושה מבחני שהוצגו כאן. Assay מבוסס CPE היה assay הראשון שפותח כדי להעריך אם מתחם הראה שום יעילות אנטי ושמש למסך ספריית מתחם גדולה. בינתיים, cytotoxicity של antivirals יכול גם להיות מוערך באמצעות assay מבוסס CPE. Assay מנת התגובה נועד לקבוע את טווח היעילות לנגיפים שנבחרו, כלומר 50% ריכוז מעכב (IC 50) או ריכוז יעיל (50 EC), כמו גם מגוון של cytotoxicity (CC 50). Assay TOA הועסק ללימוד משרד החקלאות הראשוני כדי לקבוע את המנגנון הבסיסי של antivirals הרומן במהלך מחזור חיים נגיפיים BTV או ההשפעה האפשרית על מנגנון תאי מארח. מבחני אלה הם חיוניים להערכת יעילות אנטי במערכת תרבית תאים, והיה בשימוש במשך המחקרים האחרונים שלנו להובילing לזיהוי של מספר התרופות אנטי רומן נגד BTV.

Introduction

BTV הוא וירוס RNA כפול גדילי אב טיפוס בסוג Orbivirus, משפחת Reoviridae. BTV הוא אחת המחלות החשובות ביותר של בעלי חיים מקומיים, ובם כבשים, עז, בקר וחיות בית אחרות, עם אובדן 3000000000 $ / שנה ברחבי העולם 1,2. סרוטיפ BTV האקזוטי הוא פתוגן בעלי חיים חשוב מופיע בסעיף 'פתוגנים משק החי התוצאה USDA גבוהה ". לאחרונה, מחדש מתפתח של BTV גרם להתפרצות גדולה של מחלה בבקר וצאן במספר המדינות באירופה הצפונית 3,4. כתוצאה מהמשמעות הכלכלית שלה כמערכת מודל, BTV כבר את הנושא של מחקרים מולקולריים, גנטיים ומבניים נרחבים, ומספר חיסונים פותחו. עם זאת, בשל המחסור במבחנים ראויים לגילוי תרופות אנטי, אין antivirals זמין נגד BTV.

בהקרנת תפוקה גבוהה לאחרונה במסע פרסום (HTS) תוך שימוש BTV כמערכת המודל, אנחנו דeveloped, מותאם ומאומתים assay מבוסס CPE לזהות antivirals ספקטרום רחב הפוטנציאלי נגד arboviruses 5. assay מבוסס CPE הוא assay מוכר היטב כי כבר בשימוש בגילוי תרופות אנטי נגד מספר הווירוסים שנגרם CPE / אפופטוזיס המהיר והנצפה 5-7. במערכת שלנו, זיהום BTV הודעה, CPE בא לידי ביטוי בתאים בעלי חוליות, כוללים הלה, ב.ס. ר, וHEK 293T 8. CPE-Induced BTV יכול להיות במעקב ולכמת באמצעות שיטות זיהוי כדאיות תא שונות, כוללים ערכת CellTiter Glo מגיב כדאיות תא (ערכת CTG) 9. ערכה זו קובע את מספר תאי קיימא בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצג, מה שמסמן את נוכחותם של תאי חיים פעילים מטבולית. בתנאים אופטימליים, מבוסס assay CPE מוצג כאן הראה ההיתכנות שלה עם הפרוטוקול "לערבב ולמדוד" צעד אחד, וגמישות עם אותות זורח יציבים. בינתיים, Redu תרכובות רעילותcing כדאיות תא לא ייכללו בassay מבוסס CPE זה. Assay מבוסס CPE הראה עמיד ואמין לגילוי תרופה אנטי נגד BTV שלה, ומאז משמש למסך NIH הספריות מולקולריות המולקולה קטנה Repository (MLSMR), מה שמוביל לזיהוי של שישה אשכול רומן של מתחם להוביל אנטי פוטנציאלי (ים ') 5.

כאשר תרכובת אנטי פוטנציאלית זוהתה באמצעות assay מבוסס CPE, זה יהיה צריך להיות חשוף לassay מנת תגובת עשר הריכוז כדי לקבוע את טווח היעילות וcytotoxicity 2 אנטי. היעילות אנטי, מיוצג כ50% הריכוז המעכב (50 IC) או 50% הריכוז היעיל (50 EC), היא הריכוז של תרופה אשר מעכבת באמצע הדרך CPE-induced וירוס בין קו הבסיס והמקסימום. Cytotoxicity של antivirals, כלומר ריכוז 50% cytotoxicity (CC 50), הוא הריכוזשל תרופת גרימת 50% מcytotoxicity בין קו הבסיס והמקסימום. המדד סלקטיבית (SI), מסומן כ50% SI (50 SI) מחושב מCC 50 / IC 50 הקובע את הספציפיות של נגיפים נגד CPE-induced וירוס. IC 50 (או 50 EC), CC 50 וSI 50 ערכים הם צעדים קריטיים כדי לקבוע אם תרכובת אנטי היא חזקה ובררנית לפיתוח תרופות נוסף.

כאשר נגיפים לא הראו כל רעילות גלויה במבחנה, אך וירוס מנע מושרה CPE ומחזור החיים הנגיפי היעיל, חשוב לאפיין משרד החקלאות שלה 2. אנחנו יזמנו אפיון כזה על ידי ביצוע assay TOA כדי לקבוע את הצעד האפשרי (ים) של מחזור החיים נגיפי שמושפע אנטי. באופן כללי, מתחם אנטי נוספו לתאים בזמנים שונים מראש או זיהום שלאחר וירוס. אם antivirals נוספו לתאים הנגועים לפרסם ליעד שלהTEP במהלך ההדבקה, הוא יביא לפעילות נמוכה יותר בהשוואה לזו שהתווסף לפני הצעד. לכן, מחקר TOA הוא קריטי לקביעת היעילות אנטי של מתחם, והיעד הפוטנציאלי שלו, או על מחזור החיים הנגיפי או מכונות המארח מעורבות במחזור החיים הנגיפי.

לכל שלושת מבחני, כדאיות תא נקבעה באמצעות ערכת CTG בעקבות ההוראה של היצרן 5. מערכת זיהוי זה פלטי אותות הארה הולמים שיכול להיות מנותח באמצעות תוכנות שונות בבית. כל assay קבל תוקף ומתבצע לפחות בשלושה העתקים עם שמונה העתקים. לכל הנתונים שהתקבלו, שלושה פרמטרים, כולל ערך ממוצע (AVE), סטיית תקן (STDEV), ווריאצית שיתוף יעיל (CV) נותחו על מנת לקבוע את החוסן של assay. ברגע שהחוסן של assay נקבע, הנתונים ינותחו נוספים וזממו באמצעות יוסטאטיקה וgraphi שוניםכלים ג 2.

Protocol

1. תאים, וירוסים והתרכובות אנטי שמור על תאים ב.ס. ר, נגזרת של כליות אוגר תינוק תאים (BHK) 10, במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכילה 5% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. <li style=";text-align:righ…

Representative Results

1. יעילות אנטי של מתחם Assay CPE מבוסס התאים פותח, מותאם ותוקף במבחנה באמצעות ערכת CTG מבוסס זורח לזהות antivirals רומן נגד BTV כפי שתואר לעיל 2,5. Assay התגובה עשרה המינון הועסק כדי לשקף את היעילות ורעילה לתאי נגיפים של מתחם להוביל זוהה ע…

Discussion

לזיהוי הראשוני של להיטים אנטי, אחד הצעדים המרכזיים לגילוי תרופות אנטי ופיתוח הוא לפתח מבחני חזקים, הכולל בחירת סמן לכימות, פיתוח פרוטוקול פשוט, קבלת אותות מספיקים וקורות חיים פחות מ -10%. רוב המסכים ביוכימי או מבוסס תאים נועדו לספק נקודת התחלה כימית המבוססת על assay חזק ב?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה מומן על ידי מענק 1R03MH08127-01 ו7R03MH08127-02 מ-NIH לש לי, ועל ידי קרנות IMPACT ממחלקה לרפואה ב UAB לש לי. תמיכה מקרן Molette ואוניברסיטת אובורן זוכה להערכה. אנו מודים גם assistances הטכני מהגב 'Pulin צ'ה ומר ולדימיר Musiienko במהלך העבודה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM medium Gibco 1134218 For cell culture
FBS Gibco 16000044 For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 1000185 For cell culture
DPBS Gbico 1049769 For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit Promega TB288 For cell viability measurement
70% ethanol Fisher S25309B Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10 ATCC VR-187
BSR cell Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader BioTek For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser BioTek Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate CORNING 28908031 For cell culture
Gen. 5 software BioTek For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5 GraphPad Version 5 For biostatic analysis and plot

References

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe–the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Play Video

Cite This Article
Gu, L., Schneller, S. W., Li, Q. Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus. J. Vis. Exp. (80), e50820, doi:10.3791/50820 (2013).

View Video