Medição de cálcio total em neurônios por Electron Probe X-ray Microanálise
Summary
Este artigo descreve a aplicação de microscopia eletrônica cryoanalytical para a medição quantitativa de teor de cálcio total e distribuição em resolução subcelular em espécimes biológicos fisiologicamente definidos.
Abstract
Neste artigo as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para medidas quantitativas de conteúdo elementar intracelular utilizando a técnica conhecida como microanálise eletrônica (EPMA) são descritos. Cálcio intramitocondrial é um foco especial por causa do papel crítico que a sobrecarga de cálcio mitocondrial desempenha nas doenças neurodegenerativas. O método baseia-se na análise de raios-X produzidos por um microscópio electrónico (EM) por interacção de um feixe de electrões com o espécime. A fim de manter a distribuição natural de elementos difusíveis em amostras de microscopia electrónica, EPMA requer "criofixação" de tecido, seguido pela preparação de criocortes ultrafinos. Congelamento rápido das células em cultura ou culturas organotípicas de fatias é realizada por imersão em etano líquido de congelação ou de congelação por bater contra um bloco de metal fria, respectivamente. Criosecções nominalmente 80 nm de espessura são cortadas seco, com uma faca de diamante em ca. -16076: C, montado no / grelhas de cobre revestidas com carbono pioloform, e cryotransferred num crio-EM usando um suporte cryospecimen especializado. Depois de inspecção visual e de mapeamento de localização no ≤ -160 ° C, e dose baixa de electrões, criocortes congeladas-hidratado são a -100 ° C durante ~ 30 min liofilizada. Imagens de nível Organelle de criosecções secos são registrados, também em baixas doses, por meio de uma câmera CCD-scan lento e regiões subcelulares de interesse selecionadas para análise. Raios-X emitidos por ROIs por um, focado, sonda de elétrons de alta intensidade estacionário são recolhidos por um raio-X de energia dispersiva (EDX) espectrômetro, processada pela eletrônica associados, e apresenta-se como um espectro de raios-X, ou seja, um lote de intensidade dos raios-X vs energia. O software adicional facilita: 1) identificação dos componentes elementares por suas "características" energias de pico e de impressões digitais e 2) análise quantitativa por extração de áreas de pico / fundo. Este artigo termina com dois exemplos que ilustram típicoAplicações EPMA, aquele em que a análise mitocondrial de cálcio fornecidos uma visão crítica sobre os mecanismos de lesão excitotoxic e outro que revelaram a base da resistência isquemia.
Introduction
Os íons de cálcio são, indiscutivelmente, a entidade sinalização celular mais importante e versátil em biologia, desempenhando um papel essencial nos processos normais tão diversas como a transmissão sináptica e expressão gênica. Por outro lado, o cálcio é igualmente importante na morte celular. Em particular, a desregulamentação de cálcio é um fator-chave na lesão neuronal no AVC, Parkinson, Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas 3,5. Assim, é extremamente importante para entender quantitativamente como o cálcio é distribuído no interior das células, e como isso muda após estímulos fisiológicos ou fisiopatológicos. Este objectivo é complicada pelo facto de que o cálcio é distribuído de forma dinâmica entre dois estados físicos – livre em solução ou ligada a um substrato – e que as concentrações de cálcio celular mudar ao longo de várias ordens de grandeza, como consequência da estimulação.
Embora existam vários métodos avançados disponíveis para a análise de free de cálcio intracelular, a determinação das concentrações de cálcio total em compartimentos intracelulares definidos é realisticamente limitados a uma abordagem, isto é, electrões microanálise (EPMA). EPMA é uma técnica que os casais um espectrômetro de raios-X de um microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O canhão de elétrons TEM foca, uma sonda de elétrons submicron parado em uma região subcelular de interesse e os raios-X específicos do elemento emitidas como resultado do bombardeio de elétrons são coletados e analisados (ver referências 7, 4 para análises técnicas detalhadas). Vantagens de EPMA incluem resolução de nível organela única e sensibilidade submillimolar. Na prática, no entanto, requer técnicas de criofixação EPMA especializados e instrumentação para a preparação e análise de amostras. Aqui, são descritas as ferramentas, técnicas e instrumentos adequados para a medição de cálcio intracelular utilizando EPMA. Cálcio intramitocondrial é de i especialnterest em conta o papel fundamental que mitocondriais execuções de sobrecarga de cálcio em doenças neurodegenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método analítico baseado em microscópio electrónico aqui apresentada permite a detecção, identificação, quantificação e de vários elementos de interesse biológico, incluindo Na, K, P, e especialmente Ca. Estas análises podem ser realizadas em subcelular, por exemplo, intra-organelos, a resolução devido à possibilidade de localizar e identificar as estruturas de interesse nas imagens de criocortes preparados a partir de amostras rapidamente congelados de elevada qualidade. Note que nenhuma colo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Sra. Christine A. Winters para excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Básico de Neurociências do Programa NINDS intramuros Research, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
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References
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