Misurazione del calcio totale in neuroni da Electron Probe microanalisi a raggi X
Summary
Questo documento descrive l'applicazione della microscopia elettronica cryoanalytical per la misurazione quantitativa del contenuto di calcio totale e la distribuzione a risoluzione subcellulare in campioni biologici fisiologicamente definiti.
Abstract
In questo articolo vengono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure quantitative di contenuti elementale intracellulare utilizzando la tecnica conosciuta come sonda di elettroni microanalisi (EPMA). Calcio intramitocondriale è una particolare attenzione per il ruolo fondamentale che il sovraccarico di calcio mitocondriale svolge nelle malattie neurodegenerative. Il metodo si basa sull'analisi dei raggi X generato in un microscopio elettronico (EM) per interazione di un fascio di elettroni con il campione. Al fine di mantenere la distribuzione nativo di elementi diffusibili in campioni di microscopia elettronica, EPMA richiede "cryofixation" del tessuto seguita dalla preparazione di criosezioni ultrasottili. Rapido congelamento delle cellule in coltura o colture fetta organotipica viene effettuata da tuffo congelamento in etano liquido o sbattere congelamento contro un blocco metallico freddo, rispettivamente. Criosezioni nominalmente spessore 80 nm sono tagliati a secco con un coltello di diamante a ca. -16076, C, montato su carbonio / griglie di rame pioloform rivestite, e cryotransferred in un Cryo-EM utilizzando un supporto cryospecimen specializzato. Dopo l'indagine visiva e mappatura posizione a ≤ -160 ° C e bassa dose di elettroni, criosezioni congelati-idrato sono liofilizzati a -100 ° C per ~ 30 min. Immagini a livello organello di criosezioni secchi sono registrati, anche a basse dosi, per mezzo di una telecamera CCD a lenta scansione e regioni subcellulari di interesse selezionato per l'analisi. Raggi X emessi da ROI da una, concentrata, sonda di elettroni ad alta intensità stazionaria vengono raccolti da un raggi X a dispersione di energia (EDX) spettrometro, elaborato da elettronica associata, e presentata come spettro ai raggi X, cioè un appezzamento di intensità dei raggi X vs energia. Software aggiuntivo facilita: 1) l'identificazione di componenti elementari dai loro "caratteristici" energie di picco e di impronte digitali, e 2) analisi quantitativa per estrazione delle aree dei picchi / sfondo. Questo documento si conclude con due esempi che illustrano tipiciApplicazioni EPMA, uno in cui l'analisi di calcio mitocondriale disponibile una visione critica dei meccanismi di danno excitotoxic e un altro che rivelavano la base della resistenza ischemia.
Introduction
Gli ioni calcio sono senza dubbio l'entità segnalazione cellulare più importante e versatile in biologia, gioca un ruolo fondamentale nei processi normali diversi come trasmissione sinaptica e l'espressione genica. D'altra parte, il calcio è ugualmente importante nella morte cellulare. In particolare, la deregolamentazione calcio è un fattore chiave nel danno neuronale in ictus, Parkinson, Alzheimer e altre malattie neurodegenerative 3,5. Pertanto, è estremamente importante capire quantitativamente come calcio è distribuito all'interno delle cellule, e come questo cambia seguente stimoli fisiologici o patofisiologici. Questo obiettivo è complicato dal fatto che il calcio è distribuita dinamicamente tra due stati fisici – liberi in soluzione o legato ad un substrato – e che le concentrazioni di calcio cellulare commutati diversi ordini di grandezza a seguito di stimolazione.
Mentre ci sono diverse metodologie avanzate disponibili per l'analisi di free calcio intracellulare, la determinazione delle concentrazioni di calcio totale in compartimenti intracellulari definiti è realisticamente limitata ad un approccio, cioè, elettrone sonda microanalisi (EPMA). EPMA è una tecnica che le coppie uno spettrometro a raggi X di un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). La pistola TEM elettronico si concentra una sonda elettronica submicronico fermo su una regione subcellulare di interesse e raggi X specifici degli elementi emessi a seguito del bombardamento di elettroni sono raccolti e analizzati (vedi riferimenti 7, 4 per dettagliate recensioni tecnici). I vantaggi di EPMA sono sola risoluzione a livello di organelli e sensibilità submillimolar. In pratica, tuttavia, richiede EPMA cryotechniques specializzati e strumentazione per la preparazione dei campioni e analisi. Qui sono descritti gli strumenti, le tecniche e gli strumenti adeguati per misure di calcio intracellulare mediante EPMA. Calcio intramitocondriale è di i particolarinterest sul conto del ruolo fondamentale che gioca mitocondriali sovraccarico di calcio nelle malattie neurodegenerative.
Protocol
Representative Results
Discussion
La base microscopio-analitiche elettrone qui presentato permette l'individuazione, l'identificazione e la quantificazione di diversi elementi di interesse biologico, compresi Na, K, P, e soprattutto Ca. Queste analisi possono essere effettuate a subcellulare, cioè, intra-organello, risoluzione a causa della capacità di localizzare e identificare le strutture di interesse in immagini di alta qualità di criosezioni preparati da campioni congelati rapidamente. Si noti che nessuna colorazione è tenuto a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la signora Christine A. Winters per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Programma Neuroscienze di base del Intramurale Programma di Ricerca NINDS, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
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References
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