Meting van totale Calcium in Neuronen door Electron Probe X-stralen micro analyse
Summary
Dit artikel beschrijft de toepassing van cryoanalytical elektronenmicroscopie aan de kwantitatieve meting van het totale gehalte aan calcium en distributie op subcellulaire resolutie in fysiologisch gedefinieerde biologische monsters.
Abstract
In dit artikel de tools, technieken en instrumenten die geschikt is voor kwantitatieve metingen van intracellulaire elementaire inhoud met behulp van de techniek die bekend staat als elektronen probe micro analyse (EPMA) worden beschreven. Intramitochondriale calcium is bijzondere aandacht vanwege de cruciale rol die mitochondriale calciumoverbelasting speelt in neurodegeneratieve aandoeningen. De methode is gebaseerd op de analyse van röntgenstralen opgewekt in een elektronenmicroscoop (EM) door interactie van een elektronenbundel het model. Om de natieve verdeling van diffundeerbare elementen elektronenmicroscopie specimens behouden EPMA vereist "Cryofixatie" weefsel gevolgd door de bereiding van ultradunne vriescoupes. Snel invriezen van gekweekte cellen of organotypische slice culturen wordt uitgevoerd door duik invriezen in vloeibaar ethaan of door slam bevriezing tegen een koude metalen blok, respectievelijk uitgevoerd. Cryosecties nominaal 80 nm dik zijn droog gesneden met een diamant mes op ca.. -16076, C, gemonteerd op koolstof /-pioloform gecoate koperen roosters, en cryotransferred in een cryo-EM behulp van een gespecialiseerde cryospecimen houder. Na visueel onderzoek en locatie mapping op ≤ -160 ° C en lage dosis elektronen, bevroren gehydrateerd vriescoupes gevriesdroogd bij -100 ° C voor ~ 30 minuten. Organel-niveau afbeeldingen gedroogde vriescoupes worden geregistreerd, zelfs bij lage doses, door een langzame scan CCD camera en subcellulaire regio's geselecteerd voor analyse belang. Röntgenstralen uitgezonden door ROI door een stationaire, gerichte hoge intensiteit elektronen probe worden verzameld door een energie-dispersieve röntgen (EDX) spectrometer, verwerkt door bijbehorende elektronica en gepresenteerd als een X-ray spectrum, dat wil zeggen een perceel van X-ray intensiteit versus energie. Extra software vergemakkelijkt: 1) identificatie van elementaire componenten door hun "kenmerkende" piek energieën en vingerafdrukken, en 2) kwantitatieve analyse door extractie van piekgebieden / achtergrond. Dit artikel sluit af met twee voorbeelden die typisch illustrerenEPMA toepassingen, een waarin mitochondriale calcium analyse die kritisch inzicht in mechanismen van excitotoxische letsel en een andere die de basis van ischemie weerstand onthuld.
Introduction
Calciumionen zijn misschien wel de belangrijkste en meest veelzijdige cell signaling entiteit in de biologie, spelen een essentiële rol in normale processen zo divers als synaptische transmissie en genexpressie. Anderzijds, calcium is even belangrijk in celdood. In het bijzonder calcium deregulering is een belangrijke factor in neuronale schade beroerte, Parkinson, Alzheimer en andere neurodegeneratieve aandoeningen 3,5. Het is dus uiterst belangrijk om kwantitatief te begrijpen hoe calcium is verdeeld in cellen en hoe dit verandert na fysiologische of pathofysiologische stimuli. Dit doel wordt gecompliceerd door het feit dat calcium dynamisch verdeeld tussen twee fysieke toestanden – vrij in oplossing of gebonden aan een substraat – en die cellulaire calciumconcentraties veranderen verscheidene orden van grootte als gevolg van stimulatie.
Hoewel er verschillende geavanceerde methoden beschikbaar voor de analyse van free intracellulair calcium, is het totale gehalte aan calcium concentraties in bepaalde intracellulaire compartimenten realistisch beperkt tot een benadering, namelijk elektronen probe microanalyse (EPMA). EPMA is een techniek die paren een röntgenspectrometer een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). De TEM elektronenkanon richt een stationaire, submicron elektronen probe op een subcellulaire gebied van belang en het element-specifieke röntgenstraling als gevolg van elektronen bombardement worden verzameld en geanalyseerd (zie referenties 7, 4 voor gedetailleerde technische beoordelingen). Voordelen van EPMA omvatten enkel organel-niveau resolutie en submillimolar gevoeligheid. In de praktijk echter, EPMA vereist gespecialiseerde cryotechniques en instrumentatie voor het prepareren en analyseren. Hier, de tools, technieken en instrumenten geschikt zijn voor metingen van intracellulair calcium gebruik EPMA worden beschreven. Intramitochondriële calcium is van speciale iBELANG vanwege de cruciale rol die mitochondriale calciumoverbelasting speelt in neurodegeneratieve ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De elektronen microscoop gebaseerde analytische methode hier gepresenteerde maakt de detectie, identificatie en kwantificering van verscheidene elementen van biologisch belang, zoals Na, K, P, vooral Ca. Deze analyses kunnen op subcellulaire worden uitgevoerd, dat wil zeggen, intra-organel, resolutie als gevolg van de mogelijkheid om te lokaliseren en structuren van belang bij hoge-kwaliteit beelden van cryosecties bereid uit snel ingevroren monsters te identificeren. Merk op dat er geen kleuring nodig is om el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen mevrouw Christine A. Winters bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de Basic Neurowetenschappen Program van de NINDS Intramurale Research Program, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
References
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
