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医学

El aislamiento, la cultura, y de imágenes de Human Fetal pancreáticas grupos de células

Published: May 18, 2014
doi:
10.3791/50796
, , ,
1Pediatric Diabetes Research Center, Department of Pediatrics,University of California, San Diego

Summary

Un protocolo para aislar, cúmulos cultura, y la imagen de células de los islotes (CCI) derivadas de células pancreáticas fetales humanas se describe. El método se detallan los pasos necesarios para generar los CCI a partir de tejido, la cultura como monocapas o en suspensión en forma de agregados, y la imagen de los marcadores de proliferación y las decisiones del destino celular pancreáticas.

Abstract

Durante casi 30 años, los científicos han demostrado que CCI fetales humanos trasplantados bajo la cápsula renal de ratones desnudos maduraron en funcionamiento de las células endocrinas, como se evidencia por un aumento significativo en la circulación de péptido C humano después de la estimulación de la glucosa 1-9. Sin embargo, en vitro, génesis de células productoras de insulina de los CCI fetales humanos es baja 10; resultados que recuerdan a los últimos experimentos realizados con células madre de embriones humanos (hESC), una fuente de células que tienen una gran promesa como tratamiento terapéutico potencial para la diabetes tipo 1 renovables. Al igual que los CCI, el trasplante de células madre parcialmente diferenciado generar glucosa sensible, las células productoras de insulina, pero en la génesis vitro de células productoras de insulina de células madre es mucho menos robusto 11-17. Una comprensión completa de los factores que influyen en el crecimiento y diferenciación de las células precursoras endocrinas probablemente se necesitará de datos generados a partir de las dos comunidades culturales autóctonas y élSC. Si bien una serie de protocolos que existen para generar células productoras de insulina a partir de células madre in vitro 11-22, existen muchos menos de los CCI 10,23,24. Parte de la discrepancia probablemente proviene de la dificultad de trabajar con páncreas fetales humanos. Con ese fin, hemos continuado construyendo sobre los métodos existentes para aislar islotes fetales de páncreas humanos con edad gestacional entre 12 y 23 semanas, las células crecen como una monocapa o en suspensión, y la imagen para la proliferación celular, los marcadores pancreáticos y las hormonas humanas incluyendo glucagón y C-péptido. CCI generado por el protocolo descrito a continuación resultado de la liberación de péptido C después del trasplante bajo la cápsula renal de ratones desnudos que son similares a los niveles de C-péptido obtenido por el trasplante de tejido fresco 6. Aunque los ejemplos presentados aquí se centran en la proliferación endodermo pancreático y β génesis de células, el protocolo se puede emplear para estudiar otros aspectos del desarrollo de páncreas, Incluyendo exocrina, ductal, y otras células productoras de hormona.

Introduction

Una limitación principal de las terapias de reemplazo de insulina basados ​​en células en la diabetes tipo 1 es la escasez de islotes humanos disponibles para el trasplante. La capacidad de regular la proliferación y diferenciación de las células precursoras pancreáticas humanas en células productoras de insulina que satisfagan las demandas metabólicas de un estado deficiente de insulina sigue siendo un pilar fundamental para una terapia basada en células para tratar la diabetes tipo 1.

Hasta el advenimiento de las células productoras de insulina hESC derivados, células endocrinas pancreáticas fetales humanas o sus precursores eran vistos como fuentes potenciales de células para el trasplante clínico. Aunque el panorama científico y normativo ha cambiado en los últimos años, sigue habiendo una necesidad vital para entender cómo se desarrolla el páncreas del feto humano. Muchos ven ahora el uso terapéutico de las células fetales humanas como poco probable, sin embargo, si se han establecido métodos eficaces y seguros para expandir las células, el uso terapéutico de estas células podría agAin ser explorado. Un obstáculo importante que queda es que en la transformación in vitro de células fetales agregados pancreáticas humanas (CCI) en respuesta a la glucosa, las células secretoras endocrinas insulina es actualmente un proceso ineficiente. Aunque mucho trabajo a lo largo de casi 30 años ha dilucidado y delineado el perfil de expresión de factores de transcripción necesarios para el desarrollo de páncreas endocrino, sigue habiendo lagunas en nuestro conocimiento acerca de cómo se regula la expresión temporal de los factores de transcripción y se relaciona con la función celular.

Hasta el advenimiento de las células productoras de insulina hESC derivados, células endocrinas pancreáticas fetales humanas o sus precursores eran vistos como fuentes potenciales de células para el trasplante clínico. Aunque el panorama científico y normativo ha cambiado en los últimos años, sigue habiendo una necesidad vital para entender cómo se desarrolla el páncreas del feto humano. Muchos ven ahora el uso terapéutico de las células fetales humanas como poco probable, sin embargo, si es eficazy los métodos seguros para expandir se establecieron las células, el uso terapéutico de estas células podría volver a ser explorado. Un obstáculo importante que queda es que en la transformación in vitro de células fetales agregados pancreáticas humanas (CCI) en respuesta a la glucosa, las células secretoras endocrinas insulina es actualmente un proceso ineficiente. Aunque mucho trabajo a lo largo de casi 30 años ha dilucidado y delineado el perfil de expresión de factores de transcripción necesarios para el desarrollo de páncreas endocrino, sigue habiendo lagunas en nuestro conocimiento acerca de cómo se regula la expresión temporal de los factores de transcripción y se relaciona con la función celular.

Recientemente, el campo de células madre ha empleado el conocimiento acumulado sobre la expresión del factor de transcripción temporal durante el desarrollo de los islotes para conducir la producción de células que expresan los marcadores de células endocrinas maduras. Aunque la génesis de células productoras de insulina de células madre y células pluripotentes inducidas (IPSC) ha logrado considerables yimportantes avances en los últimos años, los protocolos más eficaces requieren dos fases de diferenciación distintas: 1) la diferenciación precoz in vitro para generar células que expresan factores de transcripción precursor de páncreas, seguido por 2) de maduración in vivo después del trasplante – un denominado "cuadro negro "período. Para avanzar, los avances en la comprensión de la biología de la maduración de los islotes subyacente en vivo, independientemente de la fuente de células, se debe entender en un nivel bioquímico. La similitud entre los resultados obtenidos con CCI y células madre sugiere que un número de procesos bioquímicos críticos que regulan la transición de las células precursoras pancreáticas humanas en células maduras, respuesta a la glucosa, la secreción de insulina in vitro siguen siendo desconocidos. Una parte central de este entendimiento será el desarrollo de nuevas metodologías para obtener poblaciones de células endocrinas funcionales a partir de células progenitoras pancreáticas y células madre no sólo habrá que apr bioquímicaoaches que aclaran los eventos de maduración, pero los métodos para analizar los cambios.

¿Por qué creemos que imágenes de células pancreáticas fetales humanas es un aspecto crítico de la identificación de los cambios en la maduración de los islotes? La respuesta radica en parte en la búsqueda histórica de generar células productoras de insulina. Tanto el modelo y los sistemas de cultivo de tejidos para los precursores de páncreas e islotes han permitido a los investigadores a explorar las diferencias significativas que existen entre la maduración de islotes de origen animal y los islotes humanos in vitro. Una limitación a la exploración de desarrollo del páncreas fetal humano es que las edades gestacionales que se pueden utilizar legalmente sólo dan lugar a agregados de células heterogéneas. Aunque las células humanas fetales aisladas parecen islotes, tinción después de cultivo in vitro de edades gestacionales 9-23 semanas revela menos de 15% contiene marcadores de células endocrinas, con la mayoría de las células no la tinción de las hormonas de los islotes. Sin embargo, después del trasplante y enin vivo la maduración, una gran mayoría de las células expresan marcadores endocrinos 6,25. Los resultados de estos estudios se hicieron eco hoy con protocolos de diferenciación hESC que sólo son capaces de generar modestas poblaciones de células endocrinas positivas hormona sola después de la diferenciación in vitro. Métodos in vitro para aumentar las poblaciones de células hormonales positivos probablemente dar una idea de los islotes en vivo la maduración. Por otra parte, la comprensión de los eventos moleculares que impulsan el desarrollo de páncreas fetal humano probablemente mejorar los esfuerzos para obtener células productoras de insulina a partir de células madre y, además delinear los mecanismos que regulan la regeneración de células β y la transdiferenciación de células pancreáticas.

Las similitudes entre las células de páncreas fetal humano y células madre de maduración se pueden extender a la función celular. Al igual que las células murinas, tanto las células fetales humanos y células madre diferenciadas no son capaces de liberar insulina en respuesta a glucosadespués de neoformación islotes in vitro 26,27. Sin embargo, tras el trasplante en ratones desnudos y maduración, ambos grupos similares al islote humanas y las células productoras de insulina derivadas de células madre presentan un fenotipo endocrino. Tres meses después del injerto, casi el 90% de las células trasplantadas de cualquiera de la población son la insulina positivo, y funciona normalmente como se determina por la liberación de péptido C 17,26. Estos resultados indican que el trasplante proporciona un contexto y no identificados señales que promueven la maduración de los islotes. Protocolos de imagen optimizados, como el que se describe aquí, para que las células pancreáticas fetales humanas ayudarán en la búsqueda de identificar los factores que modulan y aceleran la maduración. Exploración bioquímica fundamental de las células pancreáticas fetales humanos y células madre diferenciadas hacia un linaje endocrino en esta etapa de desarrollo es esencial para medir la eficiencia de la maduración.

El siguiente protocolo, se indica en Figure 1, proporciona nuestro método actual para el aislamiento de células pancreáticas fetales humanos, denominado CCI de toda páncreas fetal humano y de formación de imágenes de estas células. Este protocolo requiere una preparación inicial de las células a partir de tejido, que puede ser posteriormente cultivadas como una monocapa o en suspensión. Preparación de células para la formación de imágenes de los marcadores usados ​​comúnmente de la proliferación de células endocrinas y la maduración se describe.

Generación y obtención de imágenes de los CCI en la ausencia o presencia de una variedad de agentes químicos modificación proporciona un método rápido, en comparación con modelos de trasplante, para ayudar a identificar condiciones de cultivo y compuestos que aceleran la maduración de las células pancreáticas fetales humanos en exocrina completamente funcional, ductal, o hormona de producción de las células pancreáticas.

Protocol

Notas antes de empezar: Páncreas fetales humanas se obtuvieron a partir de los Defectos de Nacimiento Laboratorio de Investigación de la Universidad de Washington (Seattle, Washington, EE.UU.), quien cosechó el tejido. El consentimiento informado para la donación de tejidos, almacenamiento, y uso de las muestras se obtuvo de los donantes por el centro. La declaración de consentimiento protocolo se remitirá por escrito y la Universidad de California, San Diego Programa de Protección de la Investigación Humanos aprobó el estudio completo (Protocolo # 081237XT). Es esencial para mantener tanto en el páncreas fetal humano y el recipiente que contiene el páncreas en hielo durante todo el procedimiento. La disociación y la digestión deben realizarse tan rápido como sea posible. Enviar la clínica donde el páncreas fetal humano se obtuvo de la memoria intermedia para el almacenamiento y el transporte de los páncreas. (RPMI-1640 + 10% de suero humano normal (NHS), 300 mM de trehalosa SG, penicilina / estreptomicina, y fungizona). 1. Disección de humanos fetales Páncreas Disolver 5 mg de RT colagenasa XI en HBSS para dar una concentración final de 2,5 mg / ml. Filtrar esterilizar la solución con un filtro de jeringa de 0,22 micras en una estéril (autoclave) vial de centelleo y se almacenan a 4 ° C. En una campana de cultivo de tejidos, se establece 2 placas de Petri estériles, un pequeño crisol estéril (en caso de un crisol no está disponible, un pequeño vaso de precipitados puede ser sustituido), tijeras esterilizadas, y pinzas. Añadir 2 ml de HBSS a una placa de Petri para lavar el páncreas. Aspirar el líquido del tubo que contiene el páncreas fetales, dejando aproximadamente 1 ml. Retire el páncreas con fórceps en el 60 mm placa de Petri sin HBSS. Para estos experimentos, los CCI fetales se generan a partir de los páncreas fresco con edades gestacionales entre 9 y 23 semanas. Aislamiento de páncreas en edades gestionational anteriores es difícil debido al tamaño del páncreas. El protocolo es probable aplicable a edades gestacionales más allá de 23 semanas, sin embargo, la adquisición de pancreata después de este tiempo es difícil debido a las restricciones federales (US). De vez en cuando, el páncreas fetal llega con esplénica, grasa, o tejido conectivo adjunto de la disección inicial. El tejido adicional es fácilmente visible a simple vista y se debe quitar del páncreas antes de iniciar el protocolo. Enjuague el páncreas en un volumen mínimo de HBSS frío (~ 0,5 ml) en la placa de Petri. Mueva el páncreas limpiadas al pequeño crisol estéril utilizando una pinza estéril y colocar en un cubo de hielo. Colocar el crisol en un soporte para un tubo de centrífuga de 50 ml y, usando 2 pares de tijeras, cortar el páncreas vigorosamente durante varios minutos. (Por lo general, 2-5 minutos, pero el tiempo depende del tamaño y la firmeza del tejido). Técnica de corte es importante. Mantenga un lado de las tijeras en una posición fija mover solamente las asas opuestas. Las puntas de las tijeras deben descansar sobre el fondo del crisol. Continuar con el movimiento de tijera rápida para romper el páncreas en pequeñospiezas. El más pequeño de los trozos de tejido, mejor será la colagenasa funcionará. Añadir 1,5 ml de HBSS + páncreas picado hasta el vial que contiene la colagenasa y colocar en un conjunto agitador baño de agua a 37 ° C a 200 rpm durante un máximo de 10 min. No marque más de una vez durante los primeros 5 min. Tiempo de digestión depende de la calidad de los tejidos, tan poco como 6 min puede ser suficiente. El punto final es cuando las partículas son pequeñas y uniforme. Llenar el vial (10-15 ml) con HBSS frío para detener la actividad de la colagenasa. Coloque sobre hielo y permitir que los grumos se asienten durante 10 min. A menudo, en este punto, se ha producido alguna muerte celular y el ADN se libera en los medios de comunicación. Esto puede hacer que los medios de comunicación 'fibrosa'; en este caso, añadir 100 l de ADNasa (10 mg / ml) a la solución. Después de que el tejido en el vial de centelleo se ha asentado durante 10 min, aspirado de la capa superior dejando ligeramente menos de la mitad (7-8 ml). Transferir las células a un tubo cónico de 15 ml, Añadir 5 ml de HBSS. Centrifugar durante 5 min a 300 x g. Aspirar el HBSS y resuspender las células en 5 ml de medio que contienen medio RPMI-1640, glutamax, 10% de suero humano normal (NHS), 10 mM de HEPES, pH 7,2, penicilina / estreptomicina, y fungizona. Placa de 60 mm placa de Petri. Para los investigadores que tratan de generar células β, añadir HGF (10 ng / ml final) a los medios de comunicación. Además, un número de grupos han demostrado que la suplementación de los medios de cultivo con la de GLP-1 de la hormona incretina también aumenta las células β 28. Las células deben ser dejados en la suspensión durante 72 horas a agregarse y formar comunidades culturales autóctonas. Después de 72 h en suspensión, las células se pueden sembrar en la matriz de la matriz HTB9 línea celular humana tal como se describe anteriormente 29. Independientemente de las condiciones de crecimiento, los medios de comunicación deben ser cambiados cada 48 horas. 2. Inmunofluorescencia de marcadores de la Endocrine Proliferación Celular y maduración en los CCI crecer en suspensión, monocapa o en cubreobjetos de vidrio Para medir la proliferación celular, BrdU etiquetado de cualquiera de las células adherentes o células en suspensión se lleva a cabo durante 12 horas antes de la fijación de PFA. Reactivo de BrdU se diluye 1:100 y esterilizarse por filtración en medio RPMI-1640, glutamax, 10% de NHS, 10 mM de HEPES, pH 7,0, penicilina / estreptomicina, y fungizona. Para las células en suspensión: Centrifugar durante 5 min a 300 xg y medio de cultivo de aspirado. Añadir 10 ml de PBS para lavar los CCI, centrifugar durante 5 minutos a 300 xg y aspirar. Si los CCI van a ser incluidas en parafina, por favor siga el protocolo opcional de 03.01 a 03.17 para las células adherentes:. Retire el medio de cultivo y lavar las células con PBS como se describe anteriormente. Fijar las células durante 20 min con PFA al 4% a TA, luego se lava dos veces con PBS. En este punto, las placas pueden ser envueltos con Parafilm y se almacenan en PBS a 4 ° C durante hasta 1 semana. Se incuban las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 10 min a TA. Lavar las células dos veces con PBS y aplicar tampón de bloqueo (2% hacersuero tecla N, 2% de albúmina de suero bovino, glicina 50 mM diluido en PBS) durante 1 hora. Lavar las células con Tampón de Trabajo (tampón de bloqueo diluido 1:10). Diluir el anticuerpo en tampón de trabajo. Para las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio, diluya el anticuerpo en 60 l volumen total. Para las células en una placa de 6 pocillos, diluya el anticuerpo en el volumen total de 600 l. Para la tinción de múltiples epítopos, un cóctel de anticuerpos se puede aplicar. Como control, utilizar IgG o pre suero inmune en lugar del anticuerpo específico. Las muestras de control deben ser incubadas con IgG de control de la misma especie como anticuerpo primario que se utiliza. Incubar el anticuerpo primario o bien 1,5 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Aspirar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con Buffer de Trabajo en RT. Diluir el anticuerpo secundario a 1:200 para la rodamina y anticuerpos conjugados con FITC, 1:500 – 1:1000 para los anticuerpos conjugados de Alexa. Es importante tener en cuenta que todos los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz. Cubra las muestrasen papel de aluminio para evitar la pérdida de señal. Incubar durante 1 hora a TA. Opcional: Para visualizar los núcleos, DAPI se puede añadir a 1:500 durante la incubación secundaria. Esto es útil para la cuantificación de la expresión de proteínas en la población total de células. Aspirar el anticuerpo secundario y lavar 3 veces con Buffer de Trabajo en RT. Para las células cultivadas en un cubreobjetos, levante suavemente el cubreobjetos con unas pinzas mientras se está inmerso en el buffer; lavar por inmersión en PBS. Para las células cultivadas en una placa de 6 pocillos, agregar PBS para lavar y aspirar. En este punto están dispuestos a examinar con un microscopio invertido. Toque el borde del cubreobjetos suavemente sobre una Kimwipe para deshacerse del exceso de PBS. Añadir una gota de gel de montaje en un portaobjetos de vidrio y invertir el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Retire el exceso de gel de fijación mediante aspiración. Toque el cubreobjetos suavemente con el dorso de una punta de pipeta de 200 l para eliminar las burbujas. Seco a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 min o O / N a 4 ° C y examinar bajo un fluorescente o un microscopio confocal. 3. (Opcional) Inmunofluorescencia tinción de las proteínas de parafina ICC incrustados Preparar una solución de agarosa al 3% y dejar enfriar hasta 55-60 ° C. Transferir los CCI incubadas en suspensión a un tubo cónico de 15 ml, y se centrifuga a 1500 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el medio de las células y fijar con 500 l 4% PFA durante 10 minutos a temperatura ambiente. No mezclar el sedimento, a menos que el sedimento es muy grande. Lavar la pella dos veces con 750 l de PBS. Al igual que el 4% PFA, estos residuos se consideran peligrosos y deben ser eliminados de acuerdo con las especificaciones de residuos peligrosos de su institución. Agitar suavemente el sedimento celular para aflojar y añadir 150-200 l de la agarosa por la pared del tubo cónico de 15 ml. Mezclar suavemente agitando el tubo, pero no formar burbujas. Dejar solidificar a 4 ° C durante 5-10 minutos. Utilice una aguja de 21 G para desalojarel sedimento y colocar en un tubo cónico de 15 ml fresco. Inclusión en parafina y la preparación de las secciones en las diapositivas se pueden realizar en el lugar utilizando un micrótomo o por sus centros de microscopía centrales. Desparafinar tejido, hidratar y lavar con agua rápidamente. Añadir 0,2 M de glicina durante 30 min a TA para saciar el aldehído restante. Lavar el portaobjetos dos veces con PBS durante 2 minutos cada uno. Para la recuperación de antígenos, trae 10 mM citrato buffer (pH 6.0) a hervir sobre la placa caliente. Sumerja los portaobjetos en el búfer, esperar a que se vuelva a hervir, y esperar 15 min. Retirar el vaso de la placa calefactora. Espere aproximadamente 40 min para las diapositivas enfriar en el tampón. Lavar los portaobjetos dos veces con H 2 O durante 5 min cada uno, lavar los pocillos dos veces con PBS durante 5 min cada uno, bloquear con 2% de suero normal de burro en PBS durante 1 hora. Incubar con el anticuerpo primario, diluido a la concentración correcta en Tampón de Trabajo que contiene 0,2% de Triton X-100.En general, el anticuerpo primario se incubó durante la noche si la tinción para factores de transcripción y de 1,5 h si la tinción de hormonas, marcadores de la proliferación, y / o la diferenciación. Siga los pasos 2.3 a 2.9 anteriormente descritas.

Representative Results

La preparación cuidadosa de los CCI fetales es fundamental para el éxito de este protocolo. Representante imágenes de cómo las células suelen buscar en determinados períodos definidos después de la siembra se muestran en la Figura 2. Después de la purificación, los agregados de células recién chapadas aparecen racimos claras como pequeñas, dispersas que contienen pocas células (Figura 2A). Después de la primera 24 horas (Figura 2B), muchos de los grupos de células se hacen más grandes, pero numerosos grupos pequeños permanecen. Por 48 horas, los grupos se han ampliado de manera significativa, pero siguen siendo asimétrico (Figura 2C). En 72 horas, los CCI deben ser claros, relativamente uniformes en tamaño y forma (Figura 2D). Es en este punto que las células se pueden sembrar, ya sea en matrices, tales como el HTB-9, durante 24 horas antes de la inmunofluorescencia o se dejaron crecer durante 72 h otro en la ausencia o la presencia de productos químicos o fármacos que pueden alterar la expresión de los genes requerido para pancreática de células endocrinas generation. Figura 3 destaca una serie de anticuerpos utilizados para evaluar, ya sea la proliferación de la CPI o la diferenciación hacia endodermo pancreático. En la Figura 3A, los CCI se sembraron en HTB-9, se cultivaron durante 4 días, y se tiñeron para PDX1, un marcador crítico del desarrollo pancreático. Aunque la tinción in vitro de los CCI se realiza rutinariamente en nuestro laboratorio, más a menudo, los CCI fetales humanos se trasplantan bajo la cápsula renal de ratones desnudos y se dejaron proliferar y diferenciarse in vivo 6,9,30-32. En momentos específicos después del trasplante, los ratones se sacrificaron y se elimina el riñón que contiene los CCI trasplantados, fijados en el 4% de paraformaldehído y embebidos en parafina. Secuenciales secciones 5-micras se generan ya sea en el sitio usando un microtomo o por una instalación de microscopía de núcleo. Desenmascaramiento de epítopos y tinción de las proteínas de tejido embebido en parafina para microscopía de inmunofluorescencia se describe en el protocolo opcional 3.10-3.. 17 En la Figura 3B, los CCI trasplantados fueron teñidas con el marcador de células epiteliales citoqueratina pan (Panck; verde) y con Ki67 (rojo) para evaluar la proliferación celular. En otro ejemplo, tanto la insulina humana (verde) y el glucagón (de color rojo) se detectaron después del trasplante y la maduración bajo la cápsula renal de un ratón desnudo (Figura 3C). Figura 1. Diagrama de flujo de la preparación humana ICC fetal y la tinción de inmunofluorescencia. Figura 2. Preparación CCI fetal Representante a los 0, 24, 48 ó 72 horas después de placas ICC (A).en suspensión fueron imágenes inmediatamente después de la siembra, (B) 24 horas después de la siembra, hr (C) 48 después de la siembra, o (D) 72 horas después de la siembra. La barra de escala para AC, aumento de 10X = 300 m, barra de escala para D, 20 de ampliación = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. .. Figura 3 inmunofluorescencia de los CCI plated Rutinariamente, los CCI son expuestas para (A) la PDX1 marcador endodermo pancreático (verde), (B) las células endocrinas (pan-CK, verde) y proliferación (Ki67, rojo), (C) a la insulina (verde) y el glucagón (de color rojo). La barra de escala para AC, 40x = 20 micras.

Discussion

Los métodos presentados aquí permiten a uno para generar CCI de páncreas fetales humanos y, posteriormente, la imagen de los marcadores de proliferación celular y endodermo pancreático. El proceso de disociación páncreas fetal humano requiere aproximadamente 90 min, seguido por un período de formación de CPI 72 horas, un enfoque que es sustancialmente diferente de protocolos para aislar células progenitoras de células β de ratón. El protocolo presentado aquí proporciona un método reproducible que permite al investigador explorar el desarrollo de páncreas fetal humano. Dos tipos diferentes de estudios longitudinales se pueden realizar. En primer lugar, el potencial de generar tipos funcionales de células pancreáticas (células ductales, las células exocrinas y las células positivas de hormonas) de diferentes edades gestacionales se puede evaluar después del trasplante. En segundo lugar, los CCI de una sola edad gestacional pueden crecer en cultivo, tratadas con agentes farmacológicos seleccionados y trasplantados en diferentes momentos durante el cultivo de la CPI para explorar las diferenciasen el destino celular. Con el tremendo esfuerzo que está dirigidas a hESC diferenciación en células productoras de insulina, los problemas asociados con la secreción de insulina en respuesta a los estímulos fisiológicos de nuevo se están reactivando. CCI humanos proporcionan un sistema modelo único para el estudio de este aspecto crítico de la proliferación de las células del páncreas del feto y el desarrollo de células β.

Al igual que con cualquier protocolo para aislar las células de los tejidos, los detalles son fundamentales para el éxito. Hay muchos parámetros que son por desgracia fuera del control del personal del laboratorio que realizan el experimento. Dos problemas encontrados por este laboratorio incluyen la mala calidad del material de partida y la entrega de tejidos no pancreática. Tejido pancreático fetal sana es firme a un corte de tijera. Si los cortes de tejido con demasiada facilidad, es una señal de que las enzimas pancreáticas han comenzado a digerir el propio páncreas. A partir de este desafortunadamente no hay recuperación y la preparación es mejor cancelado. Con poca frecuencia, una entécnico experimentado retirar el páncreas confundirá secciones del intestino por el páncreas. Estas muestras tienen mucho más elasticidad que un páncreas y un lumen notable estarán presentes. Una vez más, estas muestras deben descartarse.

Cuando el protocolo anterior se realiza como es descrito, hay raramente cualquier problema que surja a tirar el aislamiento fuera de pista. Algunos puntos a tener en cuenta para asegurar un aislamiento liso incluyen, utilizar tijeras afiladas para cortar páncreas precisa y asegurarse de no dejar ninguna muestra de tejido demasiado grande de digerir. Si los cortes no son lo suficientemente pequeños, entonces la colagenasa no funciona con eficacia, y pocos los CCI se forman. Por el contrario, cuando se usa un nuevo lote de colagenasa, comenzar con un nivel similar si UI (unidades internacionales) para la digestión, previamente utilizadas. Sin embargo, disminuir el tiempo de incubación para asegurar que durante la digestión no se produce. Esta técnica de resolución de problemas se asegura de que la etiqueta de IU no varía significativamente de un lote a batch.

Tomado en perspectiva, esta técnica para el aislamiento de los CCI fetales humanos es relativamente estándar en el campo. La mayoría de los laboratorios confirman nuestros hallazgos que la adición de HGF a los medios de comunicación ayuda a las células sobrevivir y proliferar 33. En resumen, hemos desarrollado un método para aislar los CCI fetales humanos páncreas fresco con edades gestacionales entre 9 y 23 semanas. Las células pueden ser cultivadas como una monocapa o en suspensión para los experimentos de visualizar factores de transcripción endocrinos pancreáticos y la insulina humana.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RB3-02266) y el NIH (DK54441).

Materials

Trehalose SG Hayashibara Trehalose SG
Collagenase XI  Sigma C-9407
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 24020-117
RPMI 1640 with glutamate Life Technologies 11879020 no glucose or HEPES
Human AB Sera, Male Donors Omega Scientific HS-30
Fungizone Life Technologies 15290018
Gentamicin Solution 50 mg/ml Invitrogen 15750060
1M Hepes, pH 7.0 Life Technologies 15630080
Penicillin – Streptomycin 100X Solution Life Technologies 15070063
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Peprotech 100-39
GLP-1 Peprotech 130-08
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
Dnase Sigma DN25
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs Spectrum Laboratory Products, Inc. D210-13
PBS Gibco 14190
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey Serum  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
BrdU Life Technologies 00-0103
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) Sigma I2018
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) Sigma G2654
PDX1 (mouse monoclonal) Novus Biologicals NBP1-47910
PDX1 (goat polyclonal) AbCam 47383
PDX1 (rabbit polyclonal) AbCam 47267
AlexaFluor 546 (rabbit) Invitrogen A11010
AlexaFluor 546 (mouse) Invitrogen A11003
AlexaFluor 488 (rabbit) Invitrogen A11008
AlexaFluor 488 (mouse) Invitrogen A11001
Ki67 Lab Vision Neomarkers RM 9016-50
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) Immunotech 2128
CK19 AbD Serotech MCA 2145
DAPI Cell Signaling 4083
HTB9 cell line ATCC 5637 see Beattie 1997 reference to generate matrix
Agarose Sigma A-6013
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References

  1. Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice. Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).
  2. Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice. Diabetes. 35, 464-469 (1986).
  3. Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. Human fetal pancreas: Potential for transplantation. Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).
  4. Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas. Diabetes. 38, 448-453 (1989).
  5. Tuch, B. E. Reversal of diabetes by human fetal pancreas. Transplantation. 51, 557-562 (1991).
  6. Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS. J Mol Med. 77, 70-73 (1999).
  7. Joglekar, M. V., et al. The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells. Islets. 1, 137-147 (2009).
  8. Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro. J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).
  9. Kayali, A. G., et al. The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells. PLoS One. 7, (2012).
  10. Otonkoski, T., et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells. Diabetes. 43, 947-953 (1994).
  11. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).
  12. Xu, X., et al. Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).
  13. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).
  14. Shim, J. H., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate. Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).
  15. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).
  16. Van Hoof, D., D’Amour, K. A., German, M. S. Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).
  17. Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7, (2012).
  18. Lees, J. G., Tuch, B. E. Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny. Regen Med. 1, 327-336 (2006).
  19. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).
  20. Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells. J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).
  21. Semb, H. Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells. Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).
  22. Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters. Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).
  23. Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation. Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).
  24. Sandler, S., et al. Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters. Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).
  25. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A., Sharvetnick, N., Landes, R. G. . Pancreatic regeneration. , (1997).
  26. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells. J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).
  27. Xie, R., et al. Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).
  28. Hardikar, A. A., et al. Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin. Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).
  29. Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells. J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).
  30. Beattie, G. M., et al. Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage. Diabetes. 46, 519-523 (1997).
  31. Hayek, A., Beattie, G. M. Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets. J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).
  32. Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant. Proc. 26, 33-34 (1994).
  33. Beattie, G. M., et al. A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function. Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).

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Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek, A., King, C. C. Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters. J. Vis. Exp. (87), e50796, doi:10.3791/50796 (2014).
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