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医学

Isolamento, Cultura e Imaging di Human Fetal pancreatici gruppi di cellule

Published: May 18, 2014
doi:
10.3791/50796
, , ,
1Pediatric Diabetes Research Center, Department of Pediatrics,University of California, San Diego

Summary

Un protocollo per isolare, i cluster cultura e l'immagine delle cellule insulari (CICS) derivate da cellule pancreatiche fetali umane è descritto. Il metodo in dettaglio i passi necessari per generare ICCs dal tessuto, la cultura come monostrati o in sospensione come aggregati, e immagine per i marcatori di proliferazione e decisioni destino delle cellule pancreatiche.

Abstract

Per quasi 30 anni, gli scienziati hanno dimostrato che ICCs fetali umane trapiantate sotto la capsula renale di topi nudi maturato in funzionamento delle cellule endocrine, come evidenziato da un aumento significativo circolanti C-peptide umano in seguito alla stimolazione di glucosio 1-9. Tuttavia, in vitro, genesi di cellule produttrici di insulina da ICCs fetali umane è basso 10; risultati che ricordano recenti esperimenti effettuati con le cellule staminali embrionali umane (hESC), una fonte rinnovabile di cellule che contengono una grande promessa come trattamento terapeutico potenziale per il diabete di tipo 1. Come ICC, il trapianto di cellule staminali embrionali umane in parte differenziati generi di glucosio reattivo, cellule produttrici di insulina, ma in genesi vitro di cellule che producono insulina da cellule staminali embrionali umane è molto meno robusta 11-17. Una completa comprensione dei fattori che influenzano la crescita e la differenziazione delle cellule precursori endocrine probabilmente richiederà i dati generati da entrambi ICC e HESC. Mentre un certo numero di protocolli esistenti per generare cellule produttrici di insulina da cellule staminali embrionali umane in vitro 11-22, molto meno esistono per ICCs 10,23,24. Parte di tale discrepanza deriva probabilmente dalla difficoltà di lavorare con pancreas fetali umani. Verso questo fine, abbiamo continuato a sviluppare metodi esistenti per isolare le isole dal pancreas fetali umani con età gestazionale vanno 12-23 settimane crescere le cellule come un monostrato o in sospensione, e l'immagine per la proliferazione cellulare, marcatori pancreatici e ormoni umani compresi glucagone e C-peptide. ICCs generato dal protocollo descritto sotto il risultato nel rilascio del peptide C dopo trapianto sotto la capsula renale di topi nudi che sono simili ai livelli di peptide C ottenuti per trapianto di tessuto fresco 6. Sebbene gli esempi presentati qui si concentrano sulla proliferazione endoderma pancreatica e β genesi delle cellule, il protocollo può essere utilizzato per studiare altri aspetti dello sviluppo pancreatico, Compresi esocrino, duttale, e altre cellule che producono ormoni.

Introduction

Una limitazione principale per insulina terapie sostitutive a base di cellule nel diabete di tipo 1 è la scarsità di isole umane disponibili per il trapianto. La capacità di regolare la proliferazione e la differenziazione delle cellule precursori pancreatiche umane in cellule producenti insulina che soddisfano le esigenze metaboliche di uno stato di insulino-deficiente rimane un elemento fondamentale per una terapia cellulare per il trattamento di diabete di tipo 1.

Fino all'avvento delle cellule che producono insulina cellule staminali embrionali umane derivate, cellule endocrine del pancreas fetali umani o dei loro precursori sono stati visti come potenziali fonti di cellule per il trapianto clinico. Anche se il panorama scientifico e normativo è cambiato negli ultimi anni, rimane un bisogno vitale per capire come il pancreas fetale umano si sviluppa. Molti ora vedono l'uso terapeutico delle cellule fetali umane improbabile, se sono stati stabiliti metodi efficaci e sicuri per espandere le cellule, uso terapeutico di queste cellule potrebbe agAIN essere esplorato. Un ostacolo principale che rimane è che nella trasformazione in vitro di cellule pancreatiche fetali aggregati umani (CICS) in glucosio reattivo, insulino-secernenti cellule endocrine è attualmente un processo inefficiente. Sebbene molto lavoro su quasi 30 anni ha chiarito e delineato il profilo di espressione di fattori di trascrizione necessari per lo sviluppo del pancreas endocrino, permangono lacune nella nostra conoscenza su come espressione temporale dei fattori di trascrizione è regolata e correlata alla funzione delle cellule.

Fino all'avvento delle cellule che producono insulina cellule staminali embrionali umane derivate, cellule endocrine del pancreas fetali umani o dei loro precursori sono stati visti come potenziali fonti di cellule per il trapianto clinico. Anche se il panorama scientifico e normativo è cambiato negli ultimi anni, rimane un bisogno vitale per capire come il pancreas fetale umano si sviluppa. Molti ora vedono l'uso terapeutico delle cellule fetali umane improbabile, se efficacee metodi sicuri per espandere state stabilite le cellule, uso terapeutico di queste cellule potrebbe ancora essere esplorato. Un ostacolo principale che rimane è che nella trasformazione in vitro di cellule pancreatiche fetali aggregati umani (CICS) in glucosio reattivo, insulino-secernenti cellule endocrine è attualmente un processo inefficiente. Sebbene molto lavoro su quasi 30 anni ha chiarito e delineato il profilo di espressione di fattori di trascrizione necessari per lo sviluppo del pancreas endocrino, permangono lacune nella nostra conoscenza su come espressione temporale dei fattori di trascrizione è regolata e correlata alla funzione delle cellule.

Recentemente, il campo delle cellule staminali ha impiegato la conoscenza accumulata sulle temporale espressione del fattore di trascrizione durante lo sviluppo isolotto di guidare la produzione di cellule che esprimono i marcatori di cellule endocrine mature. Anche se la genesi di cellule produttrici di insulina da cellule staminali embrionali umane e cellule pluripotenti indotte (iPSC) ha fatto sostanziale esignificativi progressi negli ultimi anni, i protocolli più efficaci necessitano di due fasi di differenziazione distinte: 1) una differenziazione precoce in vitro per generare cellule pancreatiche che esprimono fattori di trascrizione precursori, seguiti da 2) maturazione in vivo dopo il trapianto – la cosiddetta "scatola nera "periodo. Per andare avanti, i progressi nella comprensione della biologia sottostante maturazione isolotto in vivo, indipendentemente dalla fonte di cellule, deve essere intesa a livello biochimico. La somiglianza tra i risultati ottenuti con ICCs e hESC suggerisce che un certo numero di processi biochimici critici che regolano il passaggio di cellule precursori pancreatiche umane in glucosio, reattivo, che secernono insulina cellule mature in vitro rimane sconosciuta. Una parte centrale di questa comprensione sarà quello di sviluppare nuove metodologie per derivare le popolazioni di cellule endocrine funzionali da cellule progenitrici pancreatiche e cellule staminali embrionali umane richiederà non solo ca biochimicaoaches che chiarire i fatti di maturazione, ma i metodi per analizzare i cambiamenti.

Perché crediamo che l'imaging cellule pancreatiche fetali umane è un aspetto critico di individuare cambiamenti nel isolotto di maturazione? La risposta sta in parte nella ricerca storica per generare cellule produttrici di insulina. Entrambi i sistemi tessuto-coltura modello e precursori pancreatici e isolotti hanno permesso ai ricercatori di esplorare le significative differenze che esistono tra la maturazione di isolotti animali e isolotti umani in vitro. Una limitazione all'esplorazione dello sviluppo pancreas fetale umano è che l'età gestazionale utilizzabili legalmente unicamente dar luogo ad aggregati cellulari eterogenee. Anche se le isolate cellule umane fetali assomigliano isolotti, colorazione dopo coltura in vitro di età gestazionale 9-23 settimane rivela meno del 15% contiene marcatori per le cellule endocrine, con la maggior parte delle cellule non colorazione per gli ormoni insulari. Tuttavia, dopo il trapianto e nelin vivo maturazione, la grande maggioranza delle cellule esprimono marcatori endocrine 6,25. I risultati di questi studi sono stati ripresi oggi con i protocolli di differenziazione hESC che sono solo in grado di generare popolazioni modesti di cellule endocrine positive unico ormone dopo la differenziazione in vitro in metodi per migliorare popolazioni di cellule ormonali positivi. Vitro probabilmente fornire una conoscenza in vivo isolotto maturazione. Inoltre, comprendere gli eventi molecolari che guidano lo sviluppo del pancreas fetale umano probabilmente migliorare gli sforzi per ricavare cellule produttrici di insulina da cellule staminali embrionali umane e in seguito delineare i meccanismi che regolano la rigenerazione delle cellule β e transdifferenziamento delle cellule pancreatiche.

Le somiglianze tra cellule pancreatiche fetali umane e hESC maturazione possono essere estesi per la funzione delle cellule. Come le cellule murine, sia le cellule fetali umani e hESC differenziato sono in grado di rilasciare insulina in risposta al glucosiodopo isolotto neoformazione in vitro 26,27. Tuttavia, dopo il trapianto in topi nudi e maturazione, entrambi i cluster isolotto-come umani e di cellule produttrici di insulina derivate da cellule staminali embrionali umane mostrano un fenotipo endocrino. Tre mesi dopo il trapianto, quasi il 90% delle cellule trapiantate da entrambi popolazione è insulina positivo, e funziona normalmente come determinato dal rilascio di peptide C 17,26. Questi risultati indicano che il trapianto fornisce il contesto e non identificati spunti che promuovono isolotto maturazione. Protocolli di imaging ottimizzati, come quella descritta qui, per le cellule pancreatiche fetali umani aiuteranno nella ricerca per identificare fattori che modulano e accelerano la maturazione. Fondamentale esplorazione biochimica delle cellule pancreatiche fetali umani e hESC dissociati verso un lineage endocrino in questa fase di sviluppo è essenziale per misurare l'efficienza di maturazione.

Il seguente protocollo, delineato nel Figure 1, fornisce il nostro metodo attuale per l'isolamento di cellule pancreatiche fetali umani, chiamato ICCs da tutta pancreas fetale umana e l'imaging di queste cellule. Questo protocollo richiede una preparazione iniziale di cellule da tessuto, che può essere successivamente coltivata come monostrato o in sospensione. Preparazione delle cellule per l'imaging di marcatori comunemente usati di proliferazione cellulare endocrino e maturazione è descritto.

Generazione e l'imaging di ICCs in assenza o presenza di una varietà di agenti chimici modificando offre un metodo rapido, rispetto ai modelli di trapianto, per aiutare identificare condizioni di coltura e composti che accelerano la maturazione delle cellule pancreatiche fetali umani in esocrina completamente funzionale, duttale, o ormone della produzione di cellule pancreatiche.

Protocol

Note prima di iniziare: Pancreas fetali umani sono stati ottenuti dai difetti di nascita Research Laboratory, University of Washington (Seattle, Washington, USA), che ha raccolto il tessuto. Il consenso informato per la donazione di tessuto, la conservazione e l'uso dei campioni è stato ottenuto da donatori il centro. La dichiarazione di consenso protocollo è stato fornito in forma scritta e L'Università della California, San Diego umani Protezioni di ricerca Programma approvato l'intero studio (protocollo # 081237XT). E 'essenziale per mantenere sia il pancreas fetale umano e la tenuta del contenitore pancreas in ghiaccio durante l'intera procedura. La dissociazione e la digestione devono essere eseguite più velocemente possibile. Inviare clinica dove il pancreas fetale umano è stato ottenuto dal buffer per lo stoccaggio e il trasporto del pancreas. (RPMI-1640 + 10% di siero umano normale (NHS), 300 mm trealosio SG, penicillina / streptomicina, e Fungizone). 1. Dissezione di umani fetali Pancreas Disciogliere 5 mg di collagenasi RT XI in HBSS per ottenere una concentrazione finale di 2,5 mg / ml. Filtrare sterilizzare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron in una sterile (autoclave) scintillazione flacone e conservare a 4 ° C. In una cappa di coltura di tessuti, di cui 2 piastre sterili, un piccolo crogiolo sterile (se un crogiolo non è disponibile, un piccolo bicchiere può essere sostituito), forbici, sterilizzati e pinze. Aggiungere 2 ml di HBSS ad un piatto di Petri per lavare il pancreas. Aspirare il liquido dalla provetta contenente il pancreas fetali, lasciando circa 1 ml. Rimuovere il pancreas con una pinza nella capsula di Petri 60 millimetri senza HBSS. Per questi esperimenti, ICCs fetali sono generati dal pancreas fresco con età gestazionale vanno 9-23 settimane. Isolamento dal pancreas in precedenti età gestionational è difficile a causa delle dimensioni del pancreas. Il protocollo è probabile applicabile alle età gestazionali oltre 23 settimane, tuttavia l'acquisizione di pancreata dopo questo tempo è difficile a causa di federali (US) limitazioni. Occasionalmente, il pancreas fetale arriva con splenica, grasso, o tessuto connettivo allegato dalla dissezione originale. Il tessuto supplementare è facilmente visibile ad occhio nudo e dovrebbe essere rimosso dal pancreas prima di iniziare il protocollo. Risciacquare le pancreas in un volume minimo di freddo HBSS (~ 0,5 ml) nella piastra di Petri. Spostare il pancreas puliti al piccolo crogiolo sterile con pinza sterile e posto in un secchio di ghiaccio. Porre il crogiolo in un supporto per un tubo da centrifuga da 50 ml, con 2 paia di forbici, tagliare il pancreas vigorosamente per alcuni minuti. (Generalmente 2-5 min, ma il tempo dipende dalla dimensione e compattezza del tessuto). Tecnica di taglio è importante. Tenere un lato delle forbici in una posizione fissa muovendo solo le maniglie opposte. Le punte delle forbici devono poggiare sul fondo del crogiolo. Continuare con rapido movimento a forbice per rompere le pancreas in piccolepezzi. Il più piccolo dei pezzi di tessuto, migliore è la collagenasi funzionerà. Aggiungere 1,5 ml di HBSS + pancreas tritate fino al flacone contenente la collagenasi e posto in un set shaker bagno d'acqua a 37 ° C a 200 giri al minuto per un massimo di 10 min. Non controllare più frequentemente di una volta durante i primi 5 min. Tempo di digestione dipende dalla qualità del tessuto, non più di 6 min può essere sufficiente. Il punto finale è quando le particelle sono piccole e uniformi. Riempire il flacone (10-15 ml) con HBSS freddo per interrompere l'attività collagenasi. Immettono sul ghiaccio e permettere ai grumi di stabilirsi per 10 min. Spesso a questo punto, si è verificato un certo morte cellulare e il DNA viene rilasciato nel supporto. Questo può rendere i media 'filante'; in questo caso, aggiungere 100 microlitri DNasi (10 mg / magazzino ml) alla soluzione. Dopo il tessuto nella fiala di scintillazione è depositato per 10 minuti, aspirare lo strato superiore lasciando poco meno della metà (7-8 ml). Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, Aggiungere 5 ml HBSS. Centrifugare per 5 min a 300 x g. Aspirare il HBSS e risospendere le cellule in 5 ml supporto contenente RPMI-1640, glutamax, siero umano normale 10% (NHS), 10 mM HEPES pH 7.2, penicillina / streptomicina, e fungizone. Piatto in 60 millimetri piatto di Petri. Per i ricercatori che cercano di generare cellule β, aggiungere HGF (10 ng / ml finale) ai media. Inoltre, un certo numero di gruppi hanno dimostrato che l'integrazione terreni di coltura con l'ormone incretin GLP-1 aumenta anche le cellule β 28. Le cellule devono essere lasciati in sospensione per 72 ore per aggregare e formare ICC. Dopo 72 ore in sospensione, le cellule possono essere seminate su matrice della matrice HTB9 linea cellulare umana come descritto in precedenza 29. Indipendentemente dalle condizioni di crescita, i media dovrebbero essere cambiati ogni 48 ore. 2. Immunofluorescenza di marcatori di Endocrine proliferazione e maturazione in ICCs Cresciuto in sospeso, Monolayer, o su vetrini Per misurare la proliferazione cellulare, etichettatura BrdU sia di cellule aderenti o cellule in sospensione viene eseguita per 12 ore prima del fissaggio PFA. Reagente BrdU viene diluito 1:100 e filtro sterilizzato in RPMI-1640, glutamax, il 10% NHS, 10 mM HEPES pH 7,0, penicillina / streptomicina, e Fungizone. Per le cellule in sospensione: centrifugare per 5 min a 300 xg ed aspirare terreno di coltura. Aggiungere 10 ml di PBS per lavare le ICC, centrifugare per 5 minuti a 300 xg ed aspirare. Se le ICC stanno per essere inclusi in paraffina, si prega di seguire il protocollo facoltativo 3,1-3,17 per cellule aderenti:. Togliere terreno di coltura e lavare le cellule con PBS come descritto sopra. Fissare le cellule per 20 min con 4% PFA a RT, poi lavare due volte con PBS. A questo punto, le piastre possono essere confezionate con parafilm e conservati in PBS a 4 ° C per 1 settimana. Incubare le cellule con 0,2% Triton X-100 in PBS per 10 minuti a RT. Lavare le cellule due volte con PBS e applicare Blocking Buffer (2% faresiero nkey, 2% di siero albumina bovina, glicina 50 mM diluito in PBS) per 1 ora. Lavare le cellule con tampone di lavoro (Blocking Buffer diluito 1:10). Diluire l'anticorpo in tampone di lavoro. Per cellule cresciute su vetrini, diluire l'anticorpo in 60 microlitri di volume totale. Per le cellule in un piatto da 6 pozzetti, diluire l'anticorpo in 600 microlitri di volume totale. Per colorare epitopi multipli, un cocktail di anticorpi può essere applicata. Come controllo, utilizzare IgG o pre siero immune al posto dell'anticorpo specifico. I campioni di controllo devono essere incubate con IgG di controllo dalla stessa specie come utilizzarlo anticorpo primario. Incubare l'anticorpo primario sia 1,5 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Aspirare l'anticorpo primario e lavare 3 volte con tampone di lavoro a RT. Diluire l'anticorpo secondario a 1:200 per Rodamina e FITC anticorpi coniugati, 1:500 – 1:1000 per gli anticorpi coniugati Alexa. È importante notare che tutti gli anticorpi secondari sono fotosensibili. Coprire i campionifoglio d'alluminio per prevenire la perdita di segnale. Incubare per 1 ora a RT. OPTIONAL: Per visualizzare i nuclei, DAPI può essere aggiunto in 1:500 durante l'incubazione secondario. Ciò è utile per la quantificazione dell'espressione proteica nella popolazione cellulare totale. Aspirare l'anticorpo secondario e lavare 3 volte con tampone di lavoro a RT. Per le cellule coltivate su un vetrino, sollevare delicatamente il vetrino con una pinza immersi nel buffer; lavare immergendo in PBS. Per le cellule coltivate in un 6-pozzetti, aggiungere PBS per lavare e aspirare. A questo punto sono pronti ad esaminare sotto un microscopio invertito. Toccare il bordo del vetrino delicatamente su un Kimwipe per sbarazzarsi di un eccesso di PBS. Aggiungere una goccia di gel di montaggio su un vetrino e invertire il coprioggetto sul vetrino. Rimuovere il gel di montaggio in eccesso mediante aspirazione. Toccare il vetrino delicatamente con il dorso di una punta di 200 microlitri pipetta per rimuovere le bolle. Asciugare a temperatura ambiente per circa 20 minuti o O / N a 4 ° C ed esaminare al fluorescente o microscopio confocale. 3. (Facoltativo) immunofluorescenza di proteine ​​da paraffina ICC incorporati Preparare una soluzione di agarosio al 3% e lasciare raffreddare a 55-60 ° C. Trasferire le ICCs incubate in sospensione in un tubo da 15 ml e centrifugare a 1500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supporto dalle cellule e fissare con 500 microlitri PFA 4% per 10 min a RT. Non miscelare il pellet, a meno che il pellet è molto grande. Lavare il pellet due volte con 750 microlitri di PBS. Come il 4% PFA, questo rifiuto è considerato pericoloso e deve essere smaltito secondo le specifiche di rifiuti pericolosi del vostro istituto. Flick delicatamente il pellet di cellule per allentare e aggiungere 150-200 ml di agarosio lungo la parete del tubo da 15 ml. Mescolare delicatamente sfogliando il tubo, ma non formano bolle. Lasciar solidificare a 4 ° C per 5-10 min. Utilizzare un ago 21 G a sloggiareil pellet e il luogo in un tubo da 15 ml fresco. Paraffina e la preparazione delle sezioni su vetrini può essere fatto sul posto con un microtomo o dai vostri principali strutture di microscopia. Deparaffinare tessuti, idratare e lavare con acqua rapidamente. Aggiungere 0,2 M glicina per 30 min a RT per placare l'aldeide rimanente. Lavare il vetrino due volte con PBS per 2 min ciascuno. Per il recupero di un antigene, portare 10 mM tampone citrato (pH 6.0) a bollire sulla piastra calda. Immergere i vetrini nel buffer, attendere che tornare a ebollizione, e attendere 15 min. Togliere il becher dal piastra. Attendere circa 40 minuti per le diapositive per raffreddare nel buffer. Lavare i vetrini due volte con H 2 O per 5 minuti ciascuno, lavare i vetrini due volte con PBS per 5 minuti ciascuno, bloccare con il 2% di siero asino normale in PBS per 1 ora. Incubare con anticorpo primario, diluito corretta concentrazione nel buffer di lavoro contenente 0,2% Triton X-100.In generale, l'anticorpo primario viene incubata overnight se colorazione per fattori di trascrizione e per 1,5 ore se la colorazione per ormoni, marcatori di proliferazione, e / o differenziazione. Seguire i passaggi 2,3-2,9 sopra descritte.

Representative Results

L'attenta preparazione di ICCs fetali è fondamentale per il successo di questo protocollo. Quadri rappresentativi di come le cellule tipicamente guardano periodi definiti dopo la placcatura sono mostrati nella Figura 2. Dopo la purificazione, gli aggregati di cellule appena placcati appaiono come piccoli cluster chiare sparse che contengono poche cellule (Figura 2A). Dopo le prime 24 ore (Figura 2B), molti dei gruppi di cellule diventano più grandi, ma restano numerosi piccoli gruppi. Entro 48 ore, i cluster hanno ampliato in modo significativo, ma rimangono asimmetrica (Figura 2C). A 72 ore, le ICC dovrebbero essere chiare, relativamente uniforme in termini di dimensioni e forma (Figura 2D). È a questo punto che le cellule possono essere sia piastrate su matrici, come HTB-9, per 24 ore prima di immunofluorescenza o lasciati crescere per altre 72 ore in assenza o presenza di sostanze chimiche o farmaci che possono alterare l'espressione di geni necessario per pancreatica delle cellule endocrine generation. Figura 3 mette in evidenza un certo numero di anticorpi comunemente utilizzati per valutare ICC proliferazione o il differenziamento verso endoderma pancreas. Nella Figura 3A, ICCs sono state piastrate su HTB-9, coltivate per 4 giorni, e colorate per PDX1, un marcatore critica dello sviluppo del pancreas. Anche se la colorazione in vitro di ICC viene eseguita di routine nel nostro laboratorio, più spesso, ICCs fetali umani vengono trapiantate sotto la capsula renale di topi nudi e ha permesso di proliferare e differenziarsi in vivo 6,9,30-32. A volte specificato dopo il trapianto, i topi vengono sacrificati e il rene contenente le ICCs trapiantati viene rimosso, fissate in paraformaldeide al 4%, e inclusi in paraffina. Sequenziali sezioni 5 micron vengono generati sul posto utilizzando un microtomo o da un impianto di base di microscopia. Smascheramento di epitopi e colorazione delle proteine ​​da paraffina tessuto per la microscopia a immunofluorescenza sono descritti nel protocollo facoltativo 3,10-3.17. Nella Figura 3B, ICCs trapiantati sono stati colorati con il marker delle cellule epiteliali pan citocheratina (PanCK, verde) e con Ki67 (rosso) per valutare la proliferazione cellulare. In un altro esempio, sia l'insulina umana (verde) e glucagone (rosso) sono stati rilevati dopo il trapianto e maturazione sotto la capsula renale di un topo nudo (Figura 3C). Figura 1. Diagramma di flusso preparazione ICC fetale umano e la colorazione di immunofluorescenza. Figura 2. Rappresentativa fetale preparazione ICCs a 0, 24, 48, o 72 ore dopo la placcatura. (A) ICCsin sospensione sono state ripreso subito dopo la placcatura, (B) 24 ore dopo placcatura, (C) 48 ore dopo la placcatura o (D) 72 ore dopo la placcatura. Barra della scala per AC, ingrandimento 10X = 300 micron, bar scala D, 20 ingrandimenti = 100 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. .. Figura 3 immunofluorescenza di ICCs placcati routine, ICC sono ripreso per (A) il PDX1 marcatore endoderma pancreatico (verde), (B), le cellule endocrine (pan-CK, verde) e la proliferazione (Ki67, rosso), (C) di insulina (verde) e glucagone (rosso). Barra della scala per AC, 40X di ingrandimento = 20 micron.

Discussion

I metodi qui presentati permettono di generare ICCs dal pancreas fetali umane e, successivamente, delle immagini per marcatori di proliferazione cellulare e endoderma pancreas. Il processo di dissociazione pancreas fetale umano richiesto circa 90 min, seguito da un periodo di formazione ICC 72 hr, un approccio che è sostanzialmente diverso da protocolli per isolare le cellule progenitrici cellule β da topo. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo riproducibile che consente al ricercatore di esplorare sviluppo pancreatico umano fetale. Due diversi tipi di studi longitudinali possono essere eseguite. In primo luogo, la possibilità di generare tipi funzionali di cellule del pancreas (cellule duttali, cellule esocrine, e le cellule positive ormonali) di diverse età gestazionali può essere valutata dopo il trapianto. In secondo luogo, ICC da un singolo età gestazionale possono essere coltivate in coltura, trattati con agenti farmacologici selezionati e trapiantati in diversi momenti durante la coltura ICC per esplorare le differenzenel destino delle cellule. Con gli enormi sforzi attualmente diretti a hESC differenziazione in cellule produttrici di insulina, i problemi connessi con la secrezione di insulina in risposta a stimoli fisiologici sono di nuovo in fase di rivivere. ICCs umane forniscono un sistema modello unico per studiare questo aspetto critico della proliferazione delle cellule del pancreas fetale e lo sviluppo delle cellule β.

Come con qualsiasi protocollo per isolare le cellule dai tessuti, i dettagli sono fondamentali per il successo. Un certo numero di parametri sono purtroppo di fuori del controllo del personale di laboratorio incaricato dell'esperimento. Due problemi incontrati da questo laboratorio comprendono scarsa qualità del materiale di partenza e la consegna di tessuto non-pancreatico. Tessuto pancreatico fetale sana è fermo per un taglio a forbice. Se i tagli di tessuto troppo facilmente, è un segno che gli enzimi pancreatici hanno cominciato a digerire il pancreas stesso. Da questo c'è purtroppo alcun recupero e la preparazione è meglio annullata. Raramente, in untecnico esperto rimozione del pancreas confondere sezioni dell'intestino per il pancreas. Questi campioni avranno molto più elasticità di un pancreas e un lume notevole saranno presenti. Ancora una volta, questi campioni devono essere eliminati.

Quando il protocollo di cui sopra sono seguite come descritto, raramente ci sono eventuali problemi che sorgono a gettare l'isolamento fuori pista. Alcuni punti da ricordare per garantire un isolamento liscio includono, per usare le forbici affilate per un preciso taglio pancreas e fare in modo di non lasciare alcun campione di tessuto troppo grande da digerire. Se i tagli non sono abbastanza piccolo, allora la collagenasi non funziona in modo efficace, e pochi ICCs sono formate. Al contrario, quando si utilizza un nuovo lotto di collagenasi, iniziare con un livello simile, se usati come precedentemente UI (unità internazionali) per la digestione. Tuttavia, diminuire il tempo di incubazione per assicurare che oltre digestione non si verifica. Questa tecnica di risoluzione dei problemi assicura che l'etichetta UI non varia significativamente da lotto a batch.

Preso in prospettiva, questa tecnica per l'isolamento di ICCs fetali umani è relativamente standard nel settore. La maggior parte dei laboratori hanno confermato i nostri risultati che l'aggiunta di HGF ai media aiuta le cellule sopravvivono e proliferano 33. In sintesi, abbiamo sviluppato un metodo per isolare ICCs fetali umane pancreas fresco con età gestazionale vanno 9-23 settimane. Le cellule possono essere coltivate in monostrato o in sospensione per esperimenti di visualizzare pancreas endocrino fattori di trascrizione e insulina umana.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine (RB3-02266) e il NIH (DK54441).

Materials

Trehalose SG Hayashibara Trehalose SG
Collagenase XI  Sigma C-9407
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 24020-117
RPMI 1640 with glutamate Life Technologies 11879020 no glucose or HEPES
Human AB Sera, Male Donors Omega Scientific HS-30
Fungizone Life Technologies 15290018
Gentamicin Solution 50 mg/ml Invitrogen 15750060
1M Hepes, pH 7.0 Life Technologies 15630080
Penicillin – Streptomycin 100X Solution Life Technologies 15070063
Glutamax Life Technologies 35050061
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Peprotech 100-39
GLP-1 Peprotech 130-08
Fetal Bovine Serum Invitrogen 16000-044
Dnase Sigma DN25
Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs Spectrum Laboratory Products, Inc. D210-13
PBS Gibco 14190
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey Serum  Jackson ImmunoResearch 017-000-121
BrdU Life Technologies 00-0103
anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000) Sigma I2018
anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000) Sigma G2654
PDX1 (mouse monoclonal) Novus Biologicals NBP1-47910
PDX1 (goat polyclonal) AbCam 47383
PDX1 (rabbit polyclonal) AbCam 47267
AlexaFluor 546 (rabbit) Invitrogen A11010
AlexaFluor 546 (mouse) Invitrogen A11003
AlexaFluor 488 (rabbit) Invitrogen A11008
AlexaFluor 488 (mouse) Invitrogen A11001
Ki67 Lab Vision Neomarkers RM 9016-50
pan-CK (mouse monoclonal; 1:100) Immunotech 2128
CK19 AbD Serotech MCA 2145
DAPI Cell Signaling 4083
HTB9 cell line ATCC 5637 see Beattie 1997 reference to generate matrix
Agarose Sigma A-6013
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References

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Lopez, A. D., Kayali, A. G., Hayek, A., King, C. C. Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters. J. Vis. Exp. (87), e50796, doi:10.3791/50796 (2014).
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