Los protocolos para la implementación de un<em> Escherichia coli</emSistema> Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

1. Preparación extracto crudo de la célula Preparación de extracto celular crudo durante tres días se necesitan dos personas para llevar a cabo de manera eficiente. El protocolo consiste funcionalmente de tres partes: crecimiento del cultivo (etapa 1.1 al paso 1,11), lisis celular (paso 1,12 al paso 1,37), y extraer la clarificación (paso 1,38 al paso 1,52). Se presenta dividida en día para mayor comodidad. Extracto ideal puede producir 0,75 mg / ml de deGFP de plásmido pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), y tiene una concentración de extracto celular en bruto entre 27-30 mg / ml de proteína. 4 Sin embargo , extracto de características varían de lote a lote. La siguiente receta suministra suficiente para aproximadamente 3000 reacciones individuales (6 ml de extracto celular en bruto). Si la escala hacia abajo, se recomienda utilizar no menos de 1/6 de los valores dados aquí. Por falta de tiempo, no se recomienda la ampliación. Día 1 Preparar los medios de cultivo bacteriano, cultura de la placa, y los medios de comunicación los suplementos como se describe en la Tabla 1. Ver Material Complementario 1 para las recetas. . Cepa BL21-racha de Rosetta2 de -80 ° C sobre una placa de agar 2xYT + P + cm y se incuba durante al menos 15 horas a 37 ° C o hasta que las colonias son fácilmente visibles Nota: Cloranfenicol (Cm) se utiliza para seleccionar para un plásmido codifica ARNt raros en la cepa BL21-Rosetta2. Día 2 Preparar tampones y suplementos como se describe en la Tabla 2. Ver Material Complementario 1 para las recetas. Preparar y esterilizar el material necesario para el día 3, que incluye: 6 x 4 matraces Erlenmeyer de L con una cubierta de papel de aluminio (autoclave), botellas de centrífuga estériles 4 x 1 L, embudo (autoclave), 100 g de 0,1 mm perlas de vidrio (en autoclave), 2 revolver-bares (autoclave), 1 L y 500 ml aforado (autoclave), 2 x 1 vasos L (en autoclave), 3 ml jeringa con 18 agujas G (estériles), 2-3 flBoyas de avena, 2-3 10k casetes de diálisis MWCO (estéril), cubetas. Preparar mini-cultura 1. Añadir 4 ml de medio 2xYT + P y 4 l de Cm a un tubo de cultivo estéril 12 ml y pre-caliente a 37 ° C durante 30 min. Inocular mini-cultura 1 con una colonia de la P + + placa de agar 2xYT Cm. Incubar a 220 rpm, 37 º C durante 8 h. 7 horas y 30 minutos más tarde, preparar mini-cultura 2. Añadir 50 ml de medio 2xYT + P y 50 l de Cm a un estéril matraz Erlenmeyer de 250 ml y pre-calentamiento hasta 37 º C durante 30 min. Inocular Mini-cultura 2 con 100 l de mini-cultura 1 y se incuba a 220 rpm, 37 º C durante 8 h. Día 3 Pesar cuatro 50 ml tubos Falcon estériles vacíos y masa registro en la tabla 3. Chill tubos Falcon en el hielo, los cuales se utilizarán posteriormente en el paso 1.18. 7 horas y 30 minutos después de la etapa 1.8, se preparan los medios de comunicación definitiva cultivo bacteriano. El uso de un estéril 1 L cilindro graduado, la transferencia de 660 ml de 2xYT + P i mediosnto cada uno de seis 4 matraces Erlenmeyer L y pre-caliente a 37 ° C durante 30 min Nota:. 4 L o mayor se recomienda matraces Erlenmeyer para la aireación adecuada. Añadir 6,6 ml de mini-cultivo de 2 en cada matraz Erlenmeyer de 4 l. Incubar a 220 rpm, 37 ° C hasta que el cultivo alcanza una DO de 1,5-2,0 a 600 nm (correspondiente a la fase de crecimiento semilogarítmica). Compruebe periódicamente OD con una dilución 1:10 de cultivo para la precisión Este paso debe tomar no más de 3 horas – 3 hr 45 min;. Rápido crecimiento y la colección durante la fase semilogarítmica es fundamental para la calidad del extracto. Inmediatamente después de crecimiento, transferir todas las culturas de manera uniforme en cuatro botellas de centrífuga de 1 L y centrifugar a 5000 xg durante 12 min a 4 ° C para sedimentar las células bacterianas. Aunque la centrifugación, la preparación completa de búfer S30A añadiendo 4 ml de DTT 1 M a 2 L de S30A previamente preparado. Mezclar y mantener tampón en hielo. Una vez finalizada la centrifugación, eliminar completamente sobrenadante del paso 1,12 por decanting y borrando las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril. Añadir 200 ml de tampón de S30A a 4 º C a cada una de las cuatro botellas de centrífuga, y agitar vigorosamente hasta que las botellas sedimento se solubilizó completamente sin grumos restantes. Centrifugar las cuatro botellas en 5000 g durante 12 min a 4 ° C. Retire completamente sobrenadante del paso anterior por decantación y secar las botellas de centrífuga en una toalla de papel estéril. Repita los pasos 1.15 y 1.16. Añadir 40 ml de tampón S30A a 4 º C a cada botella de centrifugación. . Transfiera cada pellet y la combinación S30A en un tubo Falcon refrigerada de 1,9) Nota: Este paso es transferir los pellets en un recipiente pequeño. Centrifugar los tubos Falcon a 2000 g durante 8 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por decantación. Re-centrifugue los tubos Falcon a 2.000 g durante 2 min a 4 ° C. Eliminar completamente el sobrenadante residual mediante una pipeta. Mantener en hielo. Pesar la fnuestros tubos Falcon con pellet y masa registro en la tabla 3. Calcula la masa de pellets, volumen de tampón S30A es necesario, y la masa de los granos necesarios sobre la base de las fórmulas específicas de la Tabla 3. Correcta carga y de cuentas latido del pellet es fundamental para hacer el extracto de la calidad, y es el paso más difícil. Se recomienda revisar el video antes de intentar. Si no se evitan las burbujas de aire y distribuir granos uniformemente resultará en el extracto de ineficiente. Añadir la cantidad de tampón S30A calculado en la Tabla 3 a cada tubo Falcon, vórtice hasta homogeneidad, y volver a hielo. Mientras se mantiene los otros tubos Falcon en hielo, añadir perlas de forma intermitente a un solo tubo Falcon en tres alícuotas, cada uno con 1/3 de las perlas totales. Después de la adición de cada alícuota de perlas, de vórtice durante 30 segundos. Coloque el tubo de Falcon en el hielo entre los pasos de vórtice y después vórtice final. Después se añade la última alícuota, garantizarperlas se distribuyen de manera uniforme. Se debe formar una pasta espesa. Prepare una punta de pipeta de 5 ml (volumen) cortando el extremo utilizando una hoja de afeitar estéril para crear una abertura de 3-4 mm. Dial pipeta 2 ml Nota: Los diferentes conjuntos de pipetas y puntas proporcionan diferentes cantidades de succión que puede no ser suficiente para tirar y soltar la solución de células cordón grueso, una punta de pipeta de 1 ml con fines eliminado puede ser usado en lugar.. Coloque 20 tubos de cuentas que superaron en hielo. Verifique alta viscosidad de la solución de célula-perla utilizando pipeta modificado. Debe ser viscoso hasta el punto de apenas sale de la punta de la pipeta durante la eyección. Si es demasiado viscoso, vuelva a ajustar la punta de la pipeta según la etapa 1.25. Si no es lo suficientemente viscoso, perlas se pueden añadir en incrementos de (masa de pellets * 0,05), a una masa máxima (masa de pellets * 5.1). Después de cada adición de perlas, vortex durante 30 segundos y volver al hielo. Vea la Figura 3a para una demostración de la viscosidad. Retire la solución de células de cuentas de tubo Falcon utilizando pipeta modificado, y transferir a un tubo de talón superando estéril, llenándolo de tres cuartos de su capacidad con una solución de células de perlas. Gira muy brevemente (1s) en un contador mini-centrifugadora para eliminar las burbujas de aire y sin redistribuir cuentas. Vea las Figuras 3b-d para imágenes fijas de tubo perlas paliza carga. Terminar añadiendo solución de células del grano para formar un menisco cóncavo. Añadir una pequeña gota de solución de células de cuentas en el interior de una tapa de tubo de bolas-de latir, teniendo cuidado de no obstaculizar el borde exterior de la tapa, de lo contrario, el tubo de talón superando no lo hará sufficientl cerca y. Toque en la tapa en una superficie plana y compruebe que no haya burbujas de aire en la parte inferior de la tapa. Tape el tubo de cuentas-golpes con el casquillo del grano, superando en el paso anterior. Mano a asistente de golpes de talón. Si se hace correctamente, la tapa debe estar bien sellado, no hay burbujas de aire Should ser visible, y poco solución de células talón (si los hay) se debe volcar fuera. Vuelva a realizar el proceso de carga si hay burbujas de aire visible o la tapa no hace cerrar completamente. Tubo Falcon Vortex desde el paso 1,24 con la solución de células del grano restante para asegurar una distribución uniforme de los granos. Repita los pasos 1.28 a 1.31 hasta que el tubo Falcon está vacía y, a continuación, repita los pasos 1.24 a 1.31 por cada tubo Falcon adicional. Conducta pasos 1,33-1,38 simultáneamente. Haga que toma auxiliar lleno de talones golpeando tubos de 1.31 y el lugar en el hielo. Una vez que dos tubos de cuentas-superando llenas se han recogido y han sido en hielo durante al menos un minuto, comience a latir de perlas. Batir un tubo durante 30 segundos a 46 rpm. Coloque boca abajo sobre hielo durante 30 segundos sin dejar de batir el otro tubo. Repita el paso anterior de tal manera que cada tubo de talón superando llenado se ha de superar para 1 min total. Repita los pasos 1,33-1,35 hasta 8 tubos de perlas llenas de batido (o el importe máximo de la centrífuga puede sostener) hAVE ha procesado. Entonces, la construcción de un aparato de filtro de 15 ml Falcon (Figura 3e). Añadir un nuevo casquillo del grano-de latir,-parte plana hacia arriba, al fondo de un Falcon de 15 ml. A continuación, retire el tapón del tubo de talón superando procesado y la columna micro-cromatografía presione firmemente en el extremo del tubo de talón superando procesada hasta que esté completamente sellada. Encajar off final de elución de la columna micro-cromatografía, y coloque la columna micro-cromatografía, elución termina abajo, en el tubo de perlas abalorios vacía. Coloque este complejo en 15 ml Falcon. Repita el procedimiento para todos los 8 tubos de cuentas-superando llenas; mantener en hielo cuando se complete. Centrífuga 8 aparatos de filtro, tubo Falcon destapado, en 6000 g durante 5 min a 4 ° C para separar el extracto de sedimento y de perlas. Verifique cada tubo perlas paliza ha producido extracto viable. Extracto correctamente batir no será turbia, y el sedimento tendrá dos capas distintas. Deseche todos los tubos turbios, y transferir el sobrenadante de los tubos no turbias i1,75 ml tubos de microcentrífuga nto individuales, teniendo tan poco pellet posible. Mantener en hielo hasta que se hayan procesado todos los tubos de cuentas-de latir. Vea la Figura 3f comparar un cordón tubo-paliza correctamente vs incorrectamente procesada. Tubos de centrífuga de microcentrífuga de paso anterior a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. Transfer-pellet libre sobrenadante en tubos de cuentas que superaron vacíos utilizando una pipeta, consolidando 500 l en un nuevo tubo de talones de latir. Incubar paso anterior, con tapas de cuentas-superando retirados, a 220 rpm, 37 º C durante 80 min. Este paso digiere restante ácidos nucleicos utilizando exonucleasas endógenos liberados durante el proceso de cuentas-el gotear, y se puede hacer de pie el tubo de talones golpeando en un tubo de cultivo de tejidos. Preparar materiales de diálisis. Preparación completa búfer S30B añadiendo 2 ml de DTT 1 M a 2 L de S30B previamente preparado. Mezclar y añadir 900 ml en cada uno de dos ererile 1 L vasos. Añadir un agitador magnético estéril en cada vaso, mantener a 4 ° C. Después del paso 1.41, extracto debe ser turbia. Consolidar extracto en alícuotas de 1,5 ml en 1,75 ml de tubos de microcentrífuga, y se centrifuga a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. Con una pipeta, consolidar sobrenadante libre de pellet en 15 ml tubos Falcon en el hielo, y mezclar bien tapando el tubo y de inversión. Ahorra 10 l de sobrenadante en hielo para el paso de 1.47. Determine la cantidad total de extracto producido, e hidratar el número necesario de 10k MWCO casetes de diálisis sumergiendo en S30B durante 2 minutos, suponiendo 2,5 ml de extracto por casete. Cargue cassettes con 2,5 ml de extracto. Cada vaso puede tardar hasta 2 cassettes; dializar, revolviendo, a 4 º C durante 3 horas Nota: la carga parcial de casetes es aceptable.. Diálisis aumenta el rendimiento de producción de proteínas. Durante el paso anterior, caracterizar la proteína extractoconcentración con un ensayo de Bradford, utilizando extracto de salvado en el paso 1.44. Ver Material Suplementario 2 para más detalles. Después de la diálisis es completa, extracto de alícuota por 1,5 ml en 1,75 ml de tubos de microcentrífuga. Centrifugar a 12000 g durante 10 min a 4 ° C. Un sedimento se forma en la parte inferior del tubo. Consolidar sobrenadante claro desde el paso anterior con la pipeta en un tubo Falcon de 15 ml en hielo. Homogeneizar por inversión de 5-10x. Sobre la base de concentración determinada por Bradford en el paso 1,47, determinar la cantidad de extracto de alícuota en 1,75 ml de tubos individuales. Cada tubo individual debe tener un volumen con 810-900 mg de proteína total. Extracto debe tener una concentración total de proteína mayor que 27 mg / ml. Este paso requiere asistencia para llevar a cabo convenientemente Nota:. Extracto Alícuota por debajo de 30 mg / ml en 30 ml de alícuotas, y la escala si la concentración es mayor, por ejemplo, el extracto de alícuota a 28 mg / ml por 30 l, y el extracto de alícuota a 32mg / ml de 28,1 l. Alícuota de extracto siguiente paso 1.50, teniendo cuidado de evitar burbujas. Extracto de flash-congelación en nitrógeno líquido Nota:. Alícuotas con las burbujas se pueden eliminar por centrifugación a 10.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C. Retire los tubos de nitrógeno líquido utilizando un colador y guardar inmediatamente a -80 ° C. Seguridad: Usar gafas de protección; las tapas de los tubos de extracto podrían desprenderse debido a la diferencia de temperatura entre el nitrógeno líquido y la temperatura ambiente. 2. Aminoácidos Preparación de la Solución Solución de aminoácidos debe ser preparado de forma masiva. La siguiente receta utiliza un kit completo de estrategia en tiempo real de Aminoácidos Sampler, el suministro suficiente para aproximadamente 11.000 reacciones individuales. Si Reducción de escala, se recomienda utilizar no menos de la mitad de un kit. Cada aminoácido en el stock se suministra a 1,5 ml, 168 mM, a excepción de la leucina en 140 mM. La composición final de la solución de aminoácidos es:leucina, 5 mM, todos los demás aminoácidos, 6 mM. Esta es la concentración de trabajo 4x. Quite todos los 20 aminoácidos entre -20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Una vez descongelado, agitar hasta que se disuelven los aminoácidos, incubando a 37 ° C si es necesario. Después se disuelven aminoácidos, poner todos los aminoácidos en hielo excepto por Asn, Phe, y Cys, que se mantuvo a temperatura ambiente. Cys puede no disolverse completamente. En hielo, añadir 12 ml de agua estéril a un tubo Falcon de 50 ml estéril. Añadir 1,5 ml de cada aminoácido en el siguiente orden, teniendo cuidado de vórtice el tubo Falcon después de cada adición y mantener la solución en hielo: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys se pueden añadir como una suspensión. Después de la adición, agitar hasta que la solución es relativamente clara, incubando a 37 ° C si es necesario. Cys puede no disolverse completamente. Alícuota amino solución de ácido en 50 tubos en26 l cada uno en el hielo. Alícuota el resto a 500 l por tubo en hielo. Los 26 ml de alícuotas se utilizarán para la calibración de extracto, mientras que los 500 ml de alícuotas se utilizarán para la preparación de tampón. Mientras alícuotas, el vórtice de stock principal con frecuencia para evitar una distribución desigual de la suspensión. Alícuotas congeladas de Flash en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Seguridad: Usar gafas de protección; las tapas de los tubos de extracto podrían desprenderse debido a la diferencia de temperatura entre el nitrógeno líquido y la temperatura ambiente. Opcional: Realice un ensayo de actividad de la solución de aminoácidos recién hecho en contra de soluciones de aminoácidos previamente realizadas. 3. Energía Preparación de la Solución Solución La energía se utiliza tanto para la calibración de extracto celular crudo y para la creación de tampón, y se debe preparar en grandes cantidades. La siguiente receta suministra suficiente para aproximadamente 10.000 reacciones individuales. Si la escala hacia abajo, es recommended utilizar no menos de 1/24 de los valores dados aquí. A medida que la solución de la energía es un costo económico significativo, los usuarios de primera vez pueden quieren preparar en escala 1/24. La composición final de la energía solución es: HEPES, pH 8 700 mM, ATP 21 mM, GTP 21 mM, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, ARNt 2,8 mg / ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, AMPc 10,5 mM, ácido folínico 0,95 mM, espermidina 14 mM, 3-PGA 420 mM. Este es 14x la concentración de trabajo. Si se desea, cada elemento individual en la Tabla 4 se puede almacenar a -80 ° C para su uso posterior. Eliminar todos los productos químicos en la Tabla 4 de -80 ° C, -20 ° C, o 4 º C a temperatura ambiente durante 30 min. Preparar soluciones madre como se describe en la Tabla 4. Ver Material Complementario 1 para las recetas. Coloque todas las soluciones en el hielo después de la preparación. En un tubo Falcon de 15 ml, añadir en el siguiente orden, teniendo cuidado de vórtice del tubo Falcon después de cada adición y mantener las soluciones on hielo: 3,6 ml de 2 M de HEPES, 144 l de agua, 1,39 ml de mezcla de nucleótidos, 576 l 50 mg / ml de ARNt, 576 l 65 mM de CoA, 276 l mM de NAD 175, 170 l mM de cAMP 650, 288 l 33,9 mM de ácido folínico , 144 l 1 M espermidina, y 3,09 ml de 1,4 M 3-PGA. Energy Solution alícuota en 50 tubos en 7 l cada uno en el hielo. Alícuota el resto a 150 l por tubo en hielo. Los 7 ml de alícuotas se utilizarán para la calibración de extracto, mientras que los 150 ml de alícuotas se utilizarán para la preparación de tampón. Mientras alícuotas, el vórtice de la frecuencia principal. Alícuotas congeladas de Flash en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Seguridad: Usar gafas de protección; las tapas de los tubos de extracto podrían desprenderse debido a la diferencia de temperatura entre el nitrógeno líquido y la temperatura ambiente. Opcional: Realice un ensayo de actividad del recién hecha Energy Solution contra Energy Solutions previamente realizadas. 4. Preparación Buffer BufPreparación fer requiere la realización de crudo celular Extraer Preparación de Aminoácido Preparación de soluciones, y Energía Preparación de soluciones. Cada buffer es exclusivo de un lote de extracto celular crudo. Mg-glutamato, K-glutamato, y la TDT (en ese orden) son optimizados en esta sección para producir reacciones con los niveles máximos de expresión. El siguiente protocolo utiliza una plantilla pre-escrita, TXTL_e (plantilla) _calibration_JoVE.xlsx (material suplementario 3), para calibrar extracto celular crudo pre-preparados y preparar buffer. Sin embargo, también se puede calibrar extracto celular crudo y preparar tampón sin la plantilla mediante la optimización de Mg-glutamato, K-glutamato, y DTT manualmente y la creación de tampón tal que, junto con el extracto, es 75% de un volumen de reacción total. Si la calibración manual, las condiciones finales de la reacción se pueden encontrar en el paso 5. Complete el formulario de "Datos Generales". Descongelar en hielo 100 mM de Mg-glutamato (4 ° C), 3 M K-glutamato (4 ° C), 6mM Solución de Aminoácidos (26 l, -80 ° C), la solución de Energía (7 l, -80 ° C), 100 mM de DTT (-20 ° C), ADN de control positivo (-20 ° C), 40% de PEG- . 8000 (4 ° C), el extracto celular en bruto (-80 ° C), y agua (4 ° C) Nota: Utilice 1 nM concentración de trabajo pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (plásmido Addgene 40019) para el control positivo (excitación 485 nm, emisión 525 nm), u otra referencia que produce alta intensidad de señal. 4 Preparar siete 10,5 reacciones mu l, probando una gama de 4-10 mM adicional de Mg-glutamato, por alícuotas de cantidades Conjunto De Mg-glutamato en tubos de microcentrífuga individuales. Nota: Aunque 10,5 reacciones mu l se preparan inicialmente, la reacción final es 10 l. Prepare la mezcla maestra, como se indica en la plantilla en "la calibración Mg-glutamato", añadiendo un extra de 80 mM de K-glutamato. Mantenga en hielo y agitar después de la adición de cada artículo Nota:. Los valores dados aquí y en la plantilla sonAdemás de las cantidades de Mg-glutamato, K-glutamato, y DTT presente en el tampón S30B utilizado para hacer extracto celular crudo. Añadir mezcla maestra a las muestras que contienen Mg-glutamato y preparar reacciones. Consulte los pasos 5.10 a 5.13 para obtener instrucciones detalladas. Ejecutar de reacción a 29 ° C, ya sea en una incubadora o un lector de placas. . Determinar la concentración de Mg-glutamato óptimo nivel de la expresión final y la máxima tasa de expresión de la proteína (Figura 4a) Nota: Los tiempos de ejecución varían según el experimento, pero suelen durar menos de 8 horas. Repita los pasos 4.2 a 4.7 para K-glutamato en "calibración K glutamato," establecer los niveles de Mg-glutamato a los encontrados en el paso 4.7. Repita los pasos 4.2 a 4.7 para la TDT en "Calibración de la TDT", se fija el contenido de Mg-glutamato a los encontrados en el paso 4.7 y los niveles de K-glutamato a los encontrados en el paso 4.8 Nota:. Hemos encontrado que añade la TDT no afecta significativamente al final los niveles de expresión. Usovalores encontrados en la calibración en "composición Buffer" para determinar la composición de tampón que estar preparado. Sobre la base de la cantidad de extracto celular crudo producido, una receta mezcla maestra se produce por un importe conjunto de buffers. Descongelar las alícuotas que se enumeran en el maestro receta mezcla en hielo. Una vez descongelado, preparar mezcla maestra, manteniendo en hielo y agitación en vórtex después de la adición de cada elemento. Alícuota por cantidad indicada en "composición Buffer". Tubos de protección de Flash-congelación en nitrógeno líquido. Aunque alícuotas, vórtice del afuste principal con frecuencia. Retire los tubos de nitrógeno líquido utilizando un colador y guardar inmediatamente a -80 ° C. Seguridad: Usar gafas de protección; las tapas de los tubos de extracto podrían desprenderse debido a la diferencia de temperatura entre el nitrógeno líquido y la temperatura ambiente. 5. Ejecución experimental de una reacción TX-TL Condiciones de reacción finales son: 8.9 a 9.9 mg / ml proteen (a partir de extracto crudo), 4,5 mM-10.5 mM de Mg-glutamato, 40-160 mM de K-glutamato, 0,33-3,33 mM de DTT, 1,5 mM de cada aminoácido excepto leucina, leucina 1,25 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM de ATP y GTP, CTP 0,9 mM y UTP, 0,2 mg / ml de ARNt, 0,26 mM de CoA, 0,33 mM de NAD, 0,75 mM AMPc, 0,068 mM de ácido folínico, espermidina 1 mM, 30 mM de 3-PGA, 2% de PEG-8000. Un TX básica -TL reacción consta de 3 partes (tubos): extracto celular en bruto, de amortiguamiento y de ADN. La relación es: tampón 75% y el extracto, DNA 25% Las reacciones pueden variar en volumen, y usamos 10 l por convención para minimizar el volumen de reacción y permitir que se ejecuta en una placa de 384 pocillos.. Volúmenes más grandes requieren agitación para la oxigenación adecuada. El siguiente protocolo utiliza una plantilla pre-escrita, TXTL_JoVE.xlsx (material suplementario 4), para llevar a cabo una reacción de 10 l. Los productos en púrpura indican los valores de entrada del usuario, y artículos en azul indican reactivos adicionales para añadir a la reacción. Sin embargo, también se puede llevar a cabo una reacción de ingeniohout la plantilla siguiendo las condiciones de reacción descritas anteriormente. Complete el formulario de "Datos Generales". En "Maestro Preparación Mezclar", inserte el valor del porcentaje de extracto del paso 4.1 en el cuadro de color púrpura. Diseñe el experimento in silico usando el "Maestro Preparación Mix" (filas 10 a 17) y "Preparación de ADN" (filas 19 a 50) secciones. En general, las constantes se pueden poner en la sección "Preparación Maestro Mix", mientras que las variables se pueden poner en la sección "Preparación de ADN". Minimizar muestras por experimento para evitar la evaporación de la muestra y experimental sesgo hora de inicio. Vea la Figura 6 para una configuración de ejemplo. En "Maestro Preparación Mezclar," añadir reactivos, tales como inductores o proteínas, que irán en todas las muestras a una concentración constante. Comenzando por la fila 14, llene las áreas sombreadas de color azul, manteniendo un reactivo a cada línea. Las unidades son proporciones relativas. En la sección "Preparación de ADN", añade ADN que será específi muestraIC. ID de la muestra # 1 y # 2 se corresponden con los controles positivos y negativos, respectivamente. ID de la muestra # 3 y arriba son modificables por el usuario para el ADN, la concentración de valores en ng / l, la longitud en pares de bases, la concentración final deseada en nM, y repeticiones (de 10 reacciones mu l). La cantidad de ADN de valores para alcanzar la concentración final deseada se calcula automáticamente. . El total a través de las sumas de las filas a 10,5 * n, donde n es el número de repeticiones Nota: Aunque el volumen de reacción final es 10 l, los cálculos suponen un volumen total de 10,5 l por reacción, para tener en cuenta el volumen perdido durante el pipeteado. En la sección "Preparación de ADN", añadir los reactivos o de ADN adicional que será específico de la muestra a las columnas azules. Concentraciones de ADN Stock en nM se pueden calcular en "Preparación de ADN", mientras que los reactivos específicos de ejemplo requieren cálculo manual basado en un volumen de reacción total de 10.5 * n. Los volúmenes introducidos se restan de la cantidad de agua de la misma fila. Retire Numbe necesariaR de tubos de tampón, extracto celular en bruto, y el control positivo bajo "Tubos de descongelar," de -20 ° C o -80 ° C y descongelar en hielo. Preparar las muestras de ADN. Para cada muestra Identificación, alícuota a cabo el ADN indicado, el agua, y elementos suministrados por el usuario por la sección "Preparación de ADN" en un tubo de microcentrífuga, a temperatura ambiente Nota:. Para evitar la pérdida de muestra, calibrados recientemente pipetas y de bajo palillo Se recomiendan puntas de pipeta y tubos de microcentrífuga. Cuando se descongelan tubos de paso 5.7, preparar la mezcla maestra que consta de tampón, extracto, y ningún artículo globales suministrados por el usuario sobre la base de las cajas de color naranja-sombreada, mantener en hielo y agitación en vórtex después de la adición de cada elemento Nota:. Extracto es extremadamente viscoso. Alícuotas con burbujas se pueden eliminar por centrifugación a 10.000 xg durante 30 segundos a 4 ° C. Añadir la cantidad de mezcla maestra se indica en las celdas naranjas en "Preparación de ADN" (columna O) para cada muestra de ADN, y mantenga a temperatura ambientetura. Tratar esto como la hora de inicio de la reacción. Vortex cada muestra, y se centrifuga a 10.000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir cualquier muestra residual y para reducir las burbujas. Si la realización de la reacción en tubos de microcentrífuga, incubar directamente a 29 ° C. . De lo contrario, una pipeta 10 l de muestra en una placa de 384 pocillos Nota: Reacciones en volúmenes superiores a los 10 l pueden requerir agitación para la oxigenación. Placa Centrifugar a 4000 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir cualquier muestra residual y para reducir las burbujas. Sellar la placa después para evitar la evaporación. Ejecute reacción a 29 ° C. Nota: Los tiempos de ejecución varían dependiendo de experimento, pero por lo general una duración de menos de 8 horas.