Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

1.. Ekipman Hazırlanması: Akış Odası, Pipetler ve Çözümleri Odasını Akış: izole endotel tüpleri (Şekil 1A bakınız) superfuse altındaki bir 24 mm x 50 mm cam lamel ile bir akış odasına kullanın. Odasını monte etmeden önce,% 3 HCl ve% 70 etanol hem cam lamelleri yıkayın ultra saf su ile durulayın, ve nitrojen gazı ile kuru. Pipetler: pipetler Üç farklı protokol sırasında kullanılır: kanülasyon, toz haline getirme, ve çivileme. Kanülasyon ve çivileme pipetler Her iki deney gününden önce yapılabilir, ancak uygun şekilde toz haline pipet lümen boyutuna kabın çapının bilgi gerektirir günüdür yapılmalıdır. Kanülasyon pipetler: lümeninden kırmızı kan hücreleri temizlemek uzun, konik uçları için bir mikropipet çektirmenin kullanılarak borosilikat cam kılcal boruları çekmek için. ~ Bir dış çapa forseps ile biter Arası% 30 learterler (~ 50-80 mikron), ve yangın cila pürüzsüz olması için ucu (Şekil 1B bakınız) daha ss. Yaklaşık 45 ° açı da pipet ipuçları yararlıdır. Triturasyon pipet: mekanik, endotel tüplerinden düz kas hücreleri ve adventisya ayırmak borosilikat cam kapiller tüpler öğütülerek pipetler yapmak için. Yukarıdaki gibi kılcal tüpleri hazırlayın ve forseps ile ucunu kırmak. İpucu: daha kolay temiz trituration pipet cam kalın duvar kırmak için yapmak için cam bir puanlama aygıtı kullanın. Endotel borular izole edilecek olan kabın dış çapından daha büyük, yaklaşık 10-20 um, denemenin gününde belirlenen iç çapı için pipet kırın. Yangın lehçe kırık uçları pürüzsüz kadar (Şekil 1C bakınız). Sabitleme pipetler: akış bölme içinde endoteliyal tüp stabilize etmek için, endotel t sağlamak için pipetler çivileme yapmakbölmenin lamel tabanına karşı UBE. Kanülasyon pipetler ile aynı şekilde, cam kılcal tüpler çekin. Uçları mühürlü kadar Sonra bir ~ 100 mikron çapında ve yangın lehçe için forseps ile biter kırmak, yuvarlak ve düz (Şekil 1D bakınız). Not: iğneleme pipet ucu tamamen kapalı değilse, sıvı lümen girecek ve deney sonuçlarını yanıltabilecek. Çözümler: ultra saf tüm çözümleri (M 18.2) H 2 O hazırlayın ve 0.2 mikron filtre ile sterilize. Çözeltilerinin osmolalitesi 285-300 mOsm arasında olduğundan emin olun. 4 ° C'de saklandığında, çözeltiler ise, yaklaşık iki hafta içinde iyi kalır Diseksiyon çözeltisi: üstün epigastrik arterin diseksiyon sırasında kullanılan tuz çözeltisi (mmol / L) olarak hazırlanmıştır: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansülfonik asit ( HEPES), 10 glikoz, 0.01 sodyum nitroprussid (SNP), bird,% 0.1 büyükbaş hayvan serum 7.4 'luk bir pH ile albumin (BSA). NO donörü SNP arter cannulate ve triturasyonun sırasında düz kas hücre çıkarılmasını kolaylaştırmak için daha kolay bunları yaparken, böylece düz kas hücreleri rahatlamanıza yardımcı dahildir. Ayrışma çözeltisi: endotel tüpün ayrışma sırasında kullanılan tuz çözeltisi (mmol / L) olarak hazırlanmıştır: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz, 2 CaCl2, ve% 0.1 BSA, 7.4 'lük bir pH değeri. Bu tamponun 1 ml'lik bir kısım için, ekleyin: 0.62 mg / ml papain, 1.5 mg / ml kolajenaz ve 1.0 mg / ml ditioeritritol. Farklı satıcılardan enzimler enzimatik aktivitesinin çeşitli düzeylerde olabilir için, bu iş için kullanılan ürün numaraları malzeme tablo içinde referans olarak dahil edilmiştir. Not: tedavisi sırasında enzim ile ayrışma tampon ve ayrışma tampon iki farklı aşamada kullanılır. Superfusion çözeltisi: superfusin için kullanılan fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)g izole edilmiş endotel boru (mmol / L) olarak hazırlanmıştır: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 7.4 'luk bir pH ile 10 glükoz ve 2 CaCl2,. Cerrahi işlemleri başlamadan önce tamponlar ve çözümler hazırlayın. 200 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içine, 4 ° C ve kısım Diseksiyon tampon 50 ml çözüm kaldırma ve buz üzerine yerleştirin. Buna ek olarak, ayrışma kısım 50 ml enzimsiz tampon ve oda sıcaklığına dengelenmeye tezgah üzerine yerleştirin. 4 ° C ile süperfüzyon çözüm çıkarın ve tezgah üstünde oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın. 2. Hayvan Preparasyon Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler ve protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, Ulusal Enstitüleri ile uyum içinde olduğundan emin olun. Burada açıklanan prosedürleri Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildiMissouri. Erkek ya da en az 9 haftalık dişi fareler kullanın ve ayrı ayrı her bir çalışma. Intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile pentobarbital sodyum (60 mg / kg) ile bir fare anestezisi. Tip: Enjeksiyon aşırı doz alınması ihtimalini azaltır önce steril tuzlu su içinde 10 mg / ml pentobarbital seyreltilmesi. Anestezi hemen pentobarbital ilk enjeksiyondan sonra sıcaklık regülasyonu tavizler, bu yüzden sıcak fare tutmak. (~ 37 ° C'ye kalibre) bir ısıtma plakasının üstüne metal bir taşıyıcı (havalandırılan alüminyum sepet) ile stabil fare sıcaklığı tutmak için iyi çalışır. Alternatif olarak, fare uygun bir mesafede konumlandırmak için dikkatli bir şekilde bir ısı lambası kullanın. Uygun anestezi düzeyi (parmak veya kuyruk tutam çekilmesi eksikliği) elde edilinceye kadar fareye her 5-10 dk izleyin. Bir ek doz 15-20 dakika sonra gerekli olabilir. Özellikle, obez yaşlı, ya da hayvan ile, doz aşımı önlemek için yavaş ve dikkatli hareket etmek en iyisidirAksi vurguladı s. Dikkatle küçük pet saç kesme ile tıraş ventral tarafındaki saç kaldırmak. Özellikle dikkat hayvana travmayı önlemek için alınmalıdır. Bu kasık bölgesine koltukaltı kapsayan bir alanda tüm saç kaldırmak için yardımcı olur. Taze bir alkollü bez ile herhangi bir gevşek yapışan saç çıkarın. Mümkün olduğunca karın duvarının kadar açığa yaymak hem ön ve arka bacaklarda ile yatan, sırtında fare yerleştirin. Gerekirse, bir şoven bir şekilde bacaklarını korumak için laboratuvar bandı kullanın. 3. Üstün Epigastrik Arter İzolasyonu Sadece kasık bölgesinin alanının üzerinde deri yoluyla küçük bir kesi olun. Altta yatan karın kası hasara kaçınarak sadece cilt kesiliyor emin olmak; ilgili arka ayaklarında dışarı her yönde lateral kesi uzatmak. Rostrally ventral göğüs kafesinin üst orta hat ve birlikte kesi devamn, ilgili ön ayakları için her iki yönde yanal olarak kesi uzanır. Cildi nazikçe kaldırın ve bağ dokusu (bkz. Şekil 3A), böylece karın kaslarındaki tüm yüzeyini açığa altta yatan kas cilt tutan koparmaya makas kullanın. Oda sıcaklığında% 0.9 'luk tuzlu su çözeltisi ile maruz kas yıkayınız. SEA küçük boyutu nedeniyle, ayrıca prosedürleri için bir stereomikroskop altında hayvan yerleştirin. Forseps ile sternum alt kısmında bulunan yağ yastığı kaldırın ve bunun üzerinden bir kesi yapmak. Altta yatan doku içine çok derin kesmek için değil emin olun, alt kaburga boyunca kesi devam edin. DENİZ görünür olmalıdır; bunu zarar vermemek için özen. Kesi tamamlandıktan sonra, oda sıcaklığında,% 0.9 tuzlu su çözeltisi ile maruz doku yıkayınız. Iskelet kasının üst katmanı geri çekildikten sonra, DENİZ ve altta yatan kas kolayca tespit edilir. İpucu: uzunluğu Notorijinal uzunluğu yaklaştığı (izolasyon üzerine ekseni boyunca kısaltmak) endotel tüpleri uzatmak için izole önce in vivo DENİZ. Forseps ve makas kullanılarak, dikkatli bir SEA altındaki ince kas tabakası tüketim. Açılı forseps kullanarak, SEA altında 6-0 ipek sütür uzunluğu geçmek ve basınçlı ve sonraki izolasyon ve temizlik sırasında vizüalizasyon damar lümeninde tutulan kan tutmak için arter ve komşu ven Arter. Karşı tarafta DENİZ ligasyonu işlemi tekrarlayın. Her iki SEA bağlandı edildikten sonra, ilgili tarafları ayırmak için karın kaslarının orta hat boyunca bir kesi yapmak. Cilt için yapıldığı gibi tamamen vücuttan abdominal kas ayırmak için dikey olarak dış kenarı boyunca devam kesi sonra, her iki yönde yanal olarak kesi uzatın. Basınçlı lümen korumak için SEA beslenen damar zarar görmesini önlemek. Csızdırmazlığı muhafaza etmek için ligasyon, yukarıdaki SEA ut ve 4 ° C diseksiyon tamponu 10 ml içeren 50 ml'lik bir beher içinde izole edilmiş kas ve arter yerleştirin. Karın diğer tarafında için prosedürü tekrar edin ve 10 dakika boyunca disseksiyon tampon maddesi içinde inkübe dokuları. (Şekil 3B) soğutulmuş (4 ° C) içeren diseksiyon odası diseksiyon tamponunda SEA içeren karın kas yerleştirin. Diseksiyon odası alt Sylgard (polidimetilsiloksan [PDMS]) ihtiva eden bir tabaka ile bir Petri kabı oluşur. Böcek işaretçilerine (0,15 mm) kullanılarak, in vivo uzunlukları (yukarıda belirtilen) yaklaştığı ve Sylgard sabitlemek için izole SEA ve karın kas germek. İpucu: Bu tür kas yönlendirmek peritonunu bakan ince tabaka üstünde olduğunu transillüminasyonun kullanarak DENİZ kolayca görünür hale getirir. Ince mikrodisseksiyon enstrümanları kullanan ve doğru ligasyon yukarı sitesinden çalışmaaşağı ucu, ilk büyük şube sitesinde (1-2 cm) kadar olan eşleştirilmiş ven ve çevresindeki doku SEA temizleyin. Sonra sadece şube sitenin üstünde ve sadece ligasyon aşağıya keserek SEA tüketim. Damar lümeninde tutulan kan kaldırmak için, SEA cannulate ve buz soğuk diseksiyon tamponu ile yıkayın. Silastic boru parçası kullanarak, buz, soğuk diseksiyon tampon içeren 5 ml şırınga bir kanülasyon pipet arka ucunu bağlamak ve SEA cannulate diseksiyon odasının içindeki ucu konumlandırmak için bir micromanipulator mikropipet sabitleyin. Eritrositlerin tüm dışarı kızarmış sonra, kanülasyon pipetle SEA kaldırmak ve diseksiyon çanak dışına pipet kaldırın. Küçük bölümler halinde her uzunluğu 1-3 mm SEA kesti. Bu kısa bölümler endotel tüplerin izolasyonunu kolaylaştırmak. 4. Endotel Tüp izolasyonu 12 mm x 75 mm cam kült doldurunbuz gibi soğuk diseksiyon tamponu ile ure tüp yarıya. Açılı forseps kullanılarak, kültür tüpüne arteryel parçaları aktarmak ve buz üzerine yerleştirin. Şu anda, ayrı bir 12 mm x 75 mm kültür tüp içinde 1 ml 'lik bir son hacme ayrışma tamponu ile sindirim enzimleri birleştiren (1.3.2 Çözümler bakınız) ve bir ısıtma bloğu ile birlikte 37 ° C'ye kadar ön ısıtma çözeltisi. Ayrışma tampon ve enzimler ısınıyor olsa da, dikkatli bir damar segmentleri içeren küçük bir hacim bırakarak kültür tüpünden diseksiyon tampon aspire. Yavaşça kalan diseksiyonu tampon yıkayacak enzimler olmadan oda sıcaklığı ayrışma tamponu ekleyin. İpucu: arteriyel parçaları, onları yerleşmek için bekleyen zaman kazanmak için kültür tüpün alt kalması ayrışma tampon yavaş yavaş böyle ekleyin. Çarpmasını en aza indirmek için 37 ° C, oda sıcaklığı (~ 24 ° C), buz (4 ° C) birden fazla aşamada tampon sıcaklıkları kaldırın. Dikkatle dissoc aspireiation damar segmentleri içeren küçük bir hacim bırakmak için emin olmak yine, kültür tüp tampon. , Isıtma bloğundan enzimleri ile ön-ısıtma ayrışma tamponunu çıkarın damar parçaları içeren kültür tüpüne enzim çözeltisinin 1 ml transferi ve ısıtma bloğu geri kültür tüpü yerleştirin. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Enzimler ile İnkübasyon sırasında, toz haline getirme pipet hazırlamak mineral yağ ile dolgu ve bir mikromanipülatör içinde monte edilmiş bir mikroenjektör üzerine sabitleyin. Ardından ayrışma tamponu 2 nl ile pipet doldurmak ve akış odasının üzerinde pipet konumlandırmak için mikroenjektör pistonu geri. 30 dakika inkübasyon sonunda, ısıtma bloğundan kültür tüpü çıkarın ve dikkatli bir şekilde yukarıdaki gibi tampon aspire. Oda sıcaklığı ayrışma 4 ml tampon ile arter parçalarının yıkayın. Not: Bu, damar segm tutmak için gerekli artıkkültür tüpün dibinde veliler, arteriyel parçaları rahatsız aslında kalıntı enzimler etkili kaldırılır sağlamak için yardımcı olur. Yavaşça 1 ml mikropipet ile aspire ve ayrışma 1 ml tampon ile akış odasının içine yerleştirin ile akış odasına transfer bir damar segmenti. Mikroenjektör içeren mikromanipülatör kullanarak, damar segmentinin bir ucuna yakın olarak toz haline pipet ucu yerleştirin. EC'lere mekanik zorlanmalara neden, ve sonra tekrar odasına çıkartmak için değil, böylece triturating pipet yavaşça (225 nl / sn) içine damar segmentini (çekilmiş 500 nl) aspire. Sindirim başarılı olursa, düz kas hücreleri ve adventisya endotel tüpünden ayrışmış olacaktır. Her yumuşak kas hücreleri kesilerek kadar öğütme tekrarlayın. Aşırı öğütme (4x veya daha fazla) ECS zarar ve agonistlerinin bunları tepkisiz hale farkında olun. İpucu:tritürasyon pipet kullanarak, boru harmanlama onu tutmak için en kısa sürede uzak endotel tüpten adventisya hareket ettirin. Not: toz haline pipet kullanarak, izole edilmiş endotel boru aspire edilir ve ayrı bir bölme içerisine transfer edilebilir. Akış yönü boyunca hizalanmış akış odasının merkezinde, endotel tüp getirin ve öğütülerek pipet çıkarın. Mikromanipülatörler Güvenli çivileme pipetler akış odasının her iki ucunda monte edilmiş ve endotel tüpün ilgili uçlarında kendi ipuçları pozisyon. Bölmenin tabanına karşı bastırın tüpün bir ucuna bir iğneleme pipet indirin. Borunun karşı ucunda, aynı şekilde ikinci çivileme pipet yerleştirin. Not: çivileme pipetler Sıralama bir değiş tokuş tüp (uzak tüpün ucundan yerleştirerek) güven altına almak ve fazla görüntüleme / deneme alanında (yakın tüpün ucuna yerleştirerek) için izin arasındadır. T Bulmahem ~ borunun her bir ucundan 50 um iyi çalışır. Iğneleme pipet tüp dokunur gibi, yavaş yavaş ve böylece in vivo uzunluğu yaklaştığı uzatmakla, borunun ekseni boyunca geri çekilmesi, daha sonra tüp sabitlemek için hazne tabanına karşı pipet basın. Süperfüzyon çözelti akışını başlayın, (Şekil 3C), endotel boru dengeye uymak için ve en az 20 dakika boyunca dinlenmeye bırakın. Endotel boru boyunca sabit sıvı akışını (süperfüzyon) muhafaza edilmesi için bir peristaltik pompa kullanmaktadır. Not: endotel boru akış odasının altındaki (~ 25 dakika) yapıştırılmış veya endotel boru yerinden oynamış olmaz sağlamak üzere sol sonra Sabitleme pipetler kaldırılabilir. 5. Boya Yükleme ve Kalsiyum Görüntüleme , Hücre içi kalsiyum yanıtlar görselleştirmek oda sıcaklığında fluo-04:00 boya endotelyal tüp yerleştirmek için (~ 24 ° C). Banyoda sıvı akışını durdurmak ve fluo-4 eklemek10 uM bir nihai yoğunlukta bölmeye AM. Daha sonra, hücre dışı boya çıkarılır ve hücre içi boya tamamen de-esterifiye edilmiş sağlamak için 20 dakika boyunca, taze PSS ile endoteliyal tüp superfuse, boya hücrelere girmesine izin vermek için 10 dakika bekleyin. Kalsiyum görüntüleme gerçekleştirin. Bu iş için, dik bir mikroskop dönen bir disk konfokal görüntüleme sistemi ile donatılmış, çevre oda sıcaklığında kullanılmıştır (Şekil 2). Bir 491 nm lazer ile floresan kalsiyum boya heyecanlandırmak ve yoğun bir dijital fotoğraf makinesi kullanarak (500-550 nm emisyona) görüntü kazanır.