عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة
Summary
نقدم التحضير لتصور والتلاعب إشارات الكالسيوم في الأم، سليمة الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. أنابيب البطانية المعزولة حديثا من الشرايين المقاومة الماوس توريد الهيكل العظمي والعضلات في الاحتفاظ مورفولوجيا الجسم الحي والإشارات الحيوية داخل وبين الخلايا المجاورة. أنابيب البطانية يمكن إعداد من microvessels من الأنسجة والأعضاء الأخرى.
Abstract
السيطرة على تدفق الدم من الأوعية الدموية المقاومة ينظم امدادات من الاوكسجين والمواد المغذية يصاحب ذلك مع إزالة الأيضية والمنتجات، كما يتضح من خلال ممارسة العضلات والهيكل العظمي. الخلايا البطانية (ECS) خط البطانية من جميع السفن المقاومة وتلعب دورا رئيسيا في التحكم في القطر (مثل البطانة التي تعتمد على توسع الأوعية)، وبالتالي، فإن حجم وتوزيع تدفق الدم الأنسجة. ويتم تنظيم المقاومة الوعائية من قبل ECS من قبل الخلايا كا 2 + إشارات، مما يؤدي إلى إنتاج autacoids إنتشاري (مثل أكسيد النيتريك وحمض الأراكيدونيك الأيض) 1-3 وفرط الاستقطاب 4،5 التي تثير على نحو سلس استرخاء الخلايا العضلية. وبالتالي فهم ديناميات البطانية كا 2 + إشارات هو خطوة رئيسية نحو فهم الآليات التي تحكم مراقبة تدفق الدم. عزل أنابيب البطانية يلغي المتغيرات التباس المرتبطة BLالعود في التجويف السفينة ومع توضيح خلايا العضلات الملساء المحيطة بالأوعية والأعصاب، والتي تؤثر على خلاف ذلك بنية EC وظيفة. هنا نقدم عزل أنابيب البطانية من الشريان الشرسوفي متفوقة (SEA) باستخدام بروتوكول الأمثل لهذه السفينة.
لعزل أنابيب البطانية من الماوس تخدير، هو ligated على البحر في الموقع للحفاظ على الدم داخل التجويف السفينة (لتسهيل تصور أنه خلال تشريح)، ويتم رفعه ورقة كاملة من عضلات البطن. يتم تشريح SEA المحيطة خالية من ألياف العضلات والهيكل العظمي والنسيج الضام، يتم مسح الدم من التجويف، ويتم تنفيذ عملية الهضم الأنزيمية خفيفة الى تمكين إزالة البرانية والأعصاب وخلايا العضلات الملساء باستخدام سحن لطيف. هذه الاستعدادات معزولة طازجة من البطانة سليمة الاحتفاظ مورفولوجيا وطنهم، مع الفردية ECS المتبقية إلى جانب وظيفيا مع بعضها البعض، وقادرة على نقل المواد الكيميائية والاشتراكية الكهربائيةgnals intercellularly من خلال تقاطعات الفجوة 6،7. بالإضافة إلى تقديم رؤية جديدة في إشارات الكالسيوم والغشاء الفيزياء الحيوية، هذه الاستعدادات تمكين الدراسات الجزيئية للتعبير الجينات والبروتينات التعريب داخل الاوعية الدموية الدقيقة البطانة الأصلية.
Introduction
في هذا البروتوكول، ونحن تصف عزل أنابيب الخلية البطانية من SEA الماوس. دعت SEA من الشريان واللوازم الصدري الدم المؤكسج الداخلية لعضلات البطن الأمامي. لدينا عمل مع SEA كنموذج يعزى إليها تقديم طويلة نسبيا، وقطاعات microvessel غير متفرعة التي هي مناسبة تماما لدراسة الأحداث الإشارات بين الخلايا الكامنة دور البطانة في حكم وتنسيق سلس استرخاء الخلايا العضلية. للراغبين في الأنسجة الأخرى من العضلات والهيكل العظمي، وجدنا هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للحصول على أنابيب البطانية من microvessels من الدماغ، الأمعاء والجهاز اللمفاوي.
الملامح الرئيسية لهذه الطريقة هي أن أطوال سليمة (1-3 ملم) من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة هي معزولة، مضمونة مقابل ساترة الزجاج في غرفة التدفق التي يتم superfused أنها مع جهاز الأمن الوقائي، وتصوير لكا 2 + اشارة 7-9 أومخوزق للإشارات الكهربائية 6،8. داخل غرفة التدفق، يتعرض النصف العلوي من أنبوب إلى حل superfusion ويستجيب لتدخلات التجريبية، في حين أن النصف السفلي (في اتصال مع ساترة) محمية وتبقى هادئة. بالإضافة إلى دراسة كل من داخل وبين الخلايا كا 2 + الأحداث يشير، وأنابيب البطانية يمكن استخدامها لكمية الوقت الحقيقي PCR لتقييم التعبير الجيني 6،10، المناعية للتحقيق في تعبير البروتين 6،10، والدراسات الكهربية لتحديد الخصائص الفيزيائية الحيوية من التوصيل الكهربائي 6،11.
وهناك العديد من المزايا لإعداد أنبوب البطانية لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية. الأول هو أن عملية العزل يوفر تمييز بسيط بين اثنين من السكان الخلية: الخلايا البطانية (التي لا تزال في تشكيل أنبوب) وخلايا العضلات الملساء (فصل على حدة؛ عادة "C" عندما شكلاسترخاء). وهذا يسمح لأخذ عينات انتقائية ودراسة خصائص فريدة من نوعها الكامنة مساهمة منها خلايا 'إلى وظيفة السفينة. الثانية، وهذا النموذج يمكن حل إشارات الأحداث الجوهرية إلى البطانة، مستقلة عن تأثير تدفق الدم، العضلات الملساء المحيطة والأعصاب، وحمة. الثالث، هو درس البطانة حين طازجة معزولة، وبالتالي تجنب التغيرات في الجينات أو التعبير البروتين المرتبطة ثقافة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف عزلة أنابيب البطانية من البحر واستخدام هذا المستحضر لتصور كا 2 + اشارة الأحداث داخل ECS التأسيسي. وقد تم تكييف هذا الإجراء من واحد وضعت أصلا لعزل أنابيب البطانية من الشرايين من العضلات المشمرة الهامستر 8. الاستفادة اختلافات طفيفة من التقنيات المقدمة هنا، ونحن عزلت أنابيب البطانية من مجموعة متنوعة من أسرة الأوعية الدموية، بما في ذلك: الشرايين تغذية عضلة الهامستر ضام والخد الشرايين الحقيبة 10، والماوس الشريان شرسوفي 6،7،9، المساريقي الماوس والدماغية (؛ وترد إشارات لعزل الأوعية المساريقي 12 والأوعية الدماغية 13 الملاحظات غير منشورة) الشرايين وmicrovessels اللمفاوي. عزل أنابيب البطانية من أسرة الأوعية الدموية الجديدة قد تتطلب تعديلات على البروتوكول الأصلي. إذا العزلة غير ناجحة، فمن الأفضل أن تبدأ من خلال تغيير أوقات الهضم:زيادة الوقت الهضم إذا أنابيب البطانية يصعب عزل من خلايا العضلات الملساء والبرانية وتقليل الوقت الهضم إذا لا يبقى أنبوب البطانية سليمة. إذا تغيير أوقات الهضم غير ناجحة، وضبط تركيز أنزيمات الهضم أو درجة الحرارة الهضم يجب أن يحاكم. خيار آخر هو للحد من القطر الداخلي للماصة سحن، مما يزيد من قوة القص في إزالة خلايا العضلات الملساء. زيادة سرعة قذف السائل يمكن أيضا أن يحاكم لنفس الغرض، لكن من المرجح أن تضر التحضير. وينبغي الاعتراف بأن ذلك قد لا يكون من الممكن عزل أنابيب البطانية سليمة من السفن في الخلايا البطانية التي لا ترتبط مع بعضها البعض بشكل جيد من البروتينات وصلي.
تم إجراء تفكك خلايا العضلات الملساء التالية الهضم الأنزيمي في البداية باستخدام pipettor على غرار اليد 8. لقد المكرر الإجراء سحن باستخدام microsyrنظام إنجي، مما أتاح العزلة ثابت من أنابيب البطانية أطول (تصل إلى 3 ملم) 6. عند استخدام هذا النظام، يتم ردم ماصة سحن مع الزيوت المعدنية لتوفير عمود السائل المستمر بين المكبس السيطرة على حركة السوائل وجهاز الأمن الوقائي الذي يحتوي على شريحة السفينة. يتم فرض incompressibility السائل جنبا إلى جنب مع القوة الدافعة المستمرة لنتائج المكبس محقنة مكروية في القص المستمر كما السفينة من خلال طرف ماصة. في المقابل، تقنيات اليد غالبا ما تستخدم لخلايا الانفصال (مثل الضغط لمبة المطاط في نهاية ماصة باستور) ينطوي على ضغط الهواء، الذي يدخل التغير في الضغط القيادة، وبالتالي تمارس القص في الطرف ماصة.
هناك مزايا متعددة لإعداد أنبوب لدراسة وظيفة بطانة الأوعية الدموية في microvessels. الأول هو أن عملية العزل يوفر السكان الأصليين متميزة متجانسة الخلوية من ECS ومو سلسالخلايا بعد المقطع. منذ ECS البقاء على اتصال جسديا وأنابيب، فهي متميزة من خلايا العضلات الملساء الفردية، التي تحتفظ تكوين "C" إذا كانت لا تزال خففت خلال سحن. وتتميز أنواع الخلايا المعنية بذلك بسهولة، على سبيل المثال عند الحصول على عينات لالتقنيات الجزيئية مثل الوقت الحقيقي PCR والمناعية 10. منذ يتم عزل أنابيب متعددة من سفينة واحدة (أو من السفن الثنائية كما فعلت لSEA)، ويمكن الحصول على البيانات الجزيئية والبيانات الفنية من نفس السفن من حيوان معين. يمكن ربط التعبير الجزيئية وهكذا مع سلوك وظيفي من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة. علاوة على ذلك، يشير كلا من الأحداث داخل وبين الخلايا الذاتية لالاوعية الدموية الدقيقة البطانة يمكن حلها مستقلة عن تأثير القوى الدورة الدموية (الضغط، التدفق)، وكلاء فعال في الأوعية نفذت في مجرى الدم (مثل الهرمونات)، أو من خلايا العضلات الملساء المحيطة بها (على سبيل المثال60؛ عبر اقتران myoendothelial 14-16)، والأعصاب 17، أو الأنسجة حمة 18.
الأهم من ذلك، منذ البطانة معزولة حديثا من microvessels المعينة، وليس هناك تغيير في النمط الظاهري الذي يرتبط إلا مع زراعة ECS 19-21. على سبيل المثال، ECS مثقف تفقد مستقبلات المسكارينية التعبير، وبالتالي تغيير ملامح إشارات الكالسيوم بهم. علاوة على ذلك، يمكن أن الخصائص الكهربية من ECS تغيير في الثقافة 22. لأن ECS الفردية تبقى جانب من خلال قنوات تقاطع الفجوة الوظيفية، ويعرض أنبوب البطانية نموذجا مثاليا لدراسة التوصيل من 2 + إشارات كهربائية والكالسيوم بين الخلايا 6،7. وينبغي أيضا الاعتراف بأن خلايا العضلات الملساء فصلها ودراستها بسهولة مع تقنيات التصحيح، المشبك عن البيانات التكميلية الكامنة وراء وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة 23.
وجود قيود مفتاح أنبوب البطانية ممركز Odel هو عدم الاستقرار في التحضير مع زيادة درجة الحرارة. في حين أثبتت تحضيراتنا من SEA مستقرة وصحية في درجة حرارة الغرفة المحيطة (~ 24 درجة مئوية) ولعدة ساعات في 32 درجة مئوية، وتدهور المورفولوجية والوظيفية تحدث في أقل من ساعة عند 37 درجة مئوية 9. وجود قيود الثاني المهم من الأنبوب البطانية هو فقدان تقاطعات myoendothelial والمجالات الإشارات الكامنة التي هي جزء لا يتجزأ من وظيفة المفوضية الأوروبية في جدار الوعاء الدموي سليمة 14-16. وينبغي أيضا الاعتراف بأن، في حين تمكن أنابيب أطول إشارات بين الخلايا لدراستها عبر مسافات كبيرة نسبيا 6، معقد إعداد أنابيب لأنها تحصل على أطول لأنه يصبح من الصعب فصل كامل المحيطة خلايا العضلات الملساء والبرانية. لقد وجدنا أن أنابيب أطول من 1-2 ملم هي أيضا أكثر صعوبة لوضع وتأمين في غرفة التدفق. في المقابل، في حين أنابيب أقصر (على سبيل المثال <1 مم) ENAبلي كا 2 + والكهربائية إشارات لدراستها 8، فهي صعبة للحفاظ خلال superfusion في غرفة التدفق. أخيرا، حتى مع العزلة الأمثل للأنابيب على المستوى الثنائي، هناك مواد كافية لتقدير التقليدية للتعبير البروتين باستخدام البقع الغربية، على الرغم من immunolabeling يوفر مؤشر التعبير البروتين والتعريب. على الرغم من هذه القيود، وأنبوب البطانية يمثل إعداد رواية لتقديم رؤية جديدة في آليات الاوعية الدموية الدقيقة وظيفة الخلايا البطانية في الجسم الحي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر الدكتور Pooneh باقر والدكتور اريكا يستكوت للتعليقات افتتاحية في إعداد المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام جائزة R37-R01-HL041026 وHL086483 لنظام الضمان الاجتماعي وF32-HL107050 لMJS. هذا المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
| Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
| Papain | Sigma | P-4762 | |
| Collagenase | Sigma | C-8051 | |
| Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
| Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
| Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
| Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
| Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| 12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| 3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
| Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| 100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| 1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
| Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
| Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
| XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
| Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |
References
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circ. Res. 78, 415-423 (1996).
- Crutchley, D. J., Ryan, J. W., Ryan, U. S., Fisher, G. H. Bradykinin-induced release of prostacyclin and thromboxanes from bovine pulmonary artery endothelial cells. Studies with lower homologs and calcium antagonists. Biochim. Biophys. Acta. 751, 99-107 (1983).
- Kruse, H. J., Grunberg, B., Siess, W., Weber, P. C. Formation of biologically active autacoids is regulated by calcium influx in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. 14, 1821-1828 (1994).
- Busse, R., et al. EDHF: bringing the concepts together. Trends Pharmacol. Sci. 23, 374-380 (2002).
- Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels in murine endothelial cells: block by intracellular calcium and magnesium. J. Gen. Physiol. 131, 125-135 (2008).
- Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. Br. J. Pharmacol. 166, 774-787 (2012).
- Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19, 757-770 (2012).
- Cohen, K. D., Jackson, W. F. Membrane hyperpolarization is not required for sustained muscarinic agonist-induced increases in intracellular Ca2+ in arteriolar endothelial cells. Microcirculation. 12, 169-182 (2005).
- Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 301, 773-783 (2011).
- Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Connexin isoform expression in smooth muscle cells and endothelial cells of hamster cheek pouch arterioles and retractor feed arteries. Microcirculation. 15, 503-514 (1908).
- Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 110, 1311-1321 (2012).
- Bagher, P., et al. Low intravascular pressure activates endothelial cell TRPV4 channels, local Ca2+ events, and IKCa channels, reducing arteriolar tone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18174-18179 (2012).
- Faraci, F. M., et al. Cerebral vascular effects of angiotensin II: new insights from genetic models. J. Cereb. Blood Flow Metab. 26, 449-455 (2006).
- Emerson, G. G., Segal, S. S. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ. Res. 87, 474-479 (2000).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9627-9632 (2008).
- Tran, C. H., et al. Endothelial Ca2+ wavelets and the induction of myoendothelial feedback. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, 1226-1242 (2012).
- Nausch, L. W., et al. Sympathetic nerve stimulation induces local endothelial Ca2+ signals to oppose vasoconstriction of mouse mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 594-602 (2012).
- Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca2+ in response to mouse cremaster muscle contraction. J Physiol. 555, 459-469 (2004).
- Colden-Stanfield, M., et al. Bradykinin-induced increases in cytosolic calcium and ionic currents in cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 61, 632-640 (1987).
- Brunner, F., Kukovetz, W. R. Radioligand binding to muscarinic receptors of bovine aortic endothelial cells. Br. J. Pharmacol. 102, 373-380 (1991).
- Tracey, W. R., Peach, M. J. Differential muscarinic receptor mRNA expression by freshly isolated and cultured bovine aortic endothelial cells. Circ. Res. 70, 234-240 (1992).
- Adams, D. J., Hill, M. A. Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).
- Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles. Microcirculation. 4, 35-50 (1997).
