JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
化学

Профилирования содержимого триацилглицерида в Бат-покровных липидов с помощью препаративной тонкослойной хроматографии и MALDI-TOF масс-спектрометрии

Published: September 05, 2013
doi:
10.3791/50757
, ,
1Graduate Program of Environmental Science,Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences,Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology,Arkansas State University

Summary

Млекопитающих покров содержит растворителей извлекаемые липиды, которые могут обеспечить химические составы характеристику отдельных видов. Эта статья представляет собой рутинную метод разделения широкие классы липидов, выделенных из покровных тканей с помощью тонкослойной хроматографии и определение профиля триацилглицерида матрицей-лазерной десорбцией / ионизации время-пролетным масс-спектрометрии.

Abstract

Покров млекопитающих включает сальных желез, которые секретируют масл нистое вещество на поверхности кожи. Выработку кожного сала является частью иммунной системы, которая защищает от болезнетворных микробов. Аномальные производство кожного сала и химический состав также клинический симптом определенных кожных заболеваний. Кожное сало содержит сложную смесь липидов, в том числе триацилглицеридов, который является видоспецифические. Широкие химические свойства, проявляемые различных классов липидов препятствуют конкретные определения кожного сала композиции. Аналитические методы липидов обычно требуют химических derivatizations, которые трудоемки и увеличение расходов на подготовку образца. Эта статья описывает, как извлечь липиды от кожного покрова млекопитающих, отдельных широких классов липидов методом тонкослойной хроматографии, и профиль содержимое триацилглицерида помощью матрицы-активированная лазерная десорбция / ионизация время пролета масс-спектрометрии. Этот надежный метод позволяет непосредственно определитьиз триацилглицерида профилей между видами и отдельными лицами, и она может быть легко применен к любой таксономической группы млекопитающих.

Introduction

Млекопитающих покровных тканей включают эпидермис, кератиновых структур (например, волос и ногтей), и экзокринных желез. Экзокринных желез сальных типа связаны с волосяными фолликулами, которые совместно именуемые пилосебационного комплекса 1. Сальные железы выделяют маслянистое экссудата на поверхности кожи называют кожного сала. Кожное сало состоит в основном из глицеролипидов (например триацилглицериды [Теги]), свободные жирные ацилы (FFAs), стериновый / восковые эфиры, и сквален. Химический состав кожного сала является видоспецифичным 2. Помимо того, что часть врожденной иммунной системы и предоставление антимикробной функцию 3, сальные липиды влияют важные физиологические процессы, включая испарительного потери воды через кожу 4, сотовой целостности и генной регуляции 5 и абсорбции лекарственного средства 6. Сальные композиции липидов также может служить признаком болезни. Измененные показатели и количество сальных бдорожные классы липидов клинические признаки заболевания, такие как обыкновенные угри, перхоть 7 8, себорейный дерматит 8, 9 астеатоз, среди прочих 10. Эпидермальные и волосы ткани включают переменные профилей, содержащих стерол и производные, теги FFAs, керамиды, фосфолипиды, и другие мелкие липидные компоненты. Поскольку покровных липиды могут функционировать в болезненных процессов, определение разницы в химическом составе меток между здоровых и больных индивидуумов могут быть полезны для клинического диагноза болезни.

Липиды обычно определяется как нерастворимые в воде органические соединения либо с неполярной или неполярный-полярных заместителей 11. Липидные структуры могут быть длинные углеводородные цепи, кислородсодержащие алканы (в том числе восковых эфиров, FFAs, спирты, кетоны и альдегиды), или сложные кольцевые структуры, такие как холестерин 12. Есть восемь основных классов липидов, основанные на структуре (FFAs, glycerolipiDS [GL], глицерофосфолипиды [GP], сфинголипидов [SP], стеролов липидов [ST], prenol липиды [PR], saccharolipids [SL] и поликетиды [PK]), которые обладают широкий спектр химических свойств в зависимости от класс 13. В связи с широким изменением химических свойств классов липидов, прямой профилирование без предварительного производных липидных молекул желательно. Один из методов возникающих в липидного исследования является тонкослойной хроматографии (ТСХ) в сочетании с матрицей-активированная лазерная десорбция / ионизация время-пролетным масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) 14.

MALDI-TOF MS широко используется в протеомного исследований для идентификации белков и связать их с конкретными аминокислотных последовательностей из-за высокоточных пептид ионной масс "отпечатков пальцев", полученных от трипсиноподобных переваривается белков 15. MALDI-TOF MS также может быть использован в профиль другие биомолекулы, включая классы липидов, таких как метки 16-18. MALDI требует использования матрицы, типчески органическое соединение, содержащее ароматические и сопряженные структуры двойной связи. Молекулы матричные служить, чтобы мягко передать энергию лазера в анализируемых, способствовать перенос протона, и производить однозарядные газофазных ионов 19-21. Ионы подвергаются поле высокого напряжения в высоком вакууме и ускоренного в масс-анализатора TOF где ионы затем отделяют различиями в скоростях, которые пропорциональны их массы к заряду соотношениях. Даже очень крупные биомолекулы могут быть ионизованы с малыми повреждениями, производя однозарядные молекулярные частицы ионов для упрощенного анализа спектра. Умение анализировать липидных молекул непосредственно, без предварительного получения производных способствовало готовый принятие MALDI-TOF MS в липидомных исследований 18.

Эта статья представляет собой обычного способа, чтобы изолировать и проанализировать покровных липиды из волос, сальных выделений и plagiopatagium Восточного красного битой (Lasiurus borealiс). Это используется для определения изменения межвидовых в Бат-покровных липидов выяснить патологический процесс в Бело-Нос синдрома (WNS) 22. WNS является грибковое заболевание летучих мышей и вызвано вновь описанных психрофильных видов Geomyces destructans 23-25. WNS вызвало гибель более 5 миллионов североамериканских летучих мышей пещерных и угрожает вымирание уязвимых видов рукокрылых, с потенциальными экономическими последствиями миллиардов долларов в ущерб сельскохозяйственной отрасли 26,27. Для исследования действия, описанные в G. destructans инфекции, липиды экстрагировали из волос и крыла тканей восточных красных летучих мышей и разделяют на широких классов липидов с помощью ТСХ, чтобы изолировать фракцию TAG для последующего анализа с помощью MALDI-TOF MS. Метки содержат короткие ацильных цепей и легко обнаруживаются по MALDI-TOF MS с небольшим вмешательством матрицы.

Protocol

ВНИМАНИЕ: Получите заранее все необходимые государственные и федеральные разрешения на обработку, транспортировку и хранение летучих мышей. Сертификаты также должны быть получены у институциональной уходу и использованию животных комитета, а также от вашего институционального комитета по биобезопасности. Если живые летучие мыши (или нервная система ткани) должны быть обработаны, обработчики животных должны быть вакцинированы от бешенства. Летучие мыши, используемые в настоящем исследовании были собраны из Озарк Св. Франциска National Forest, AR, летом 2010 года в соответствии со стандартными методами (Арканзас государственного университета Комитет Институциональная биобезопасности утверждение # 135349-1) 28. 1. Ткань Лечение и Добыча липидов До и между сбором тканей от разных людей Очистите все инструменты с метанолом. Обрезать волосы (около 1,0 г) с кожи с ножницами и поместить в 125 мл колбу Эрленмейера. Образец кожного сала из поверхности крыла, вычищая кожу 4 – 6 ватные шарики, смоченных хлороформом: Метанол растворитель (С: M; 3:02 об / об), и поместите их в отдельной колбе. Экстракт ткани с 10 мл C: M (2:1 об / об), содержащей 0,5% бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), чтобы предотвратить окисление 29. Используйте только ВЭЖХ качества растворители. Через 2 часа добавляют около 0,5 г безводного сульфата в каждую колбу, кратко смешивать и собирать растворитель путем фильтрации через фильтровальную бумагу. Повторите шаги 1.2 и 1.3 раза. После того, как с 1:01 С: М и последовательно с 1:02 C: М. Бассейн фильтратов вместе. Выпаривают объединенные фильтраты в потоке N 2, определяют сухой вес, и растворяют липидный остаток в 3:02 C: M (с 0,5% ВНТ) до концентрации 10 мг / мл. Образец Хранить в стеклянных флаконах при температуре -20 ° С. Как правило, лучше, чтобы проанализировать образцы в течение одного месяца после сбора образцов и минимизировать циклов замораживания-оттаивания. 2. Липидов Разделение препаративной тонкослойной хроматографии Подготовьте заранее растворителя промывали 1,5 мл microcentrifuge трубы, заполнив с 3:02 C: M, промывкой ацетоном и сушки на воздухе. Это делается для удаления пластификаторов, которые могут помешать позже масс-спектрометрического анализа. Храните пробирки с образцами в контейнере пыли и обрабатывать эти трубы только в перчатках, чтобы предотвратить загрязнение от кожных масел. Активируйте пластинки ТСХ сначала предварительно ее развитии с 3:02 C: М. Добавьте достаточно растворителя к камере ТСХ на глубину 1 см, затем поместить пластину в камере (близко со стеклянной крышкой) и растворитель позволит запустить полностью в верхней части пластины. Это займет около 45 мин. Удалите пластину и сухой в вытяжной шкаф, пока растворитель испаряется (около 15 мин), затем поместите в духовку, по крайней мере 10 мин при 120 ° С Поместите карандашом отметку в верхней части пластины для поддержания ориентации, когда образцы применяются. Поместите прямую линию карандашом, 1,5 см от нижнего края пластины, чтобы отметить базовый, куда будут помещаться образец и стандарты. Подготовка TLC камеру путем разрезаниякусок фильтровальной бумаги, достаточно большой, чтобы выровнять два коротких стенок и один длинный стенки. Положите бумагу лайнер фильтра в камеру. Это будет полностью влажным, когда растворитель добавляют к камере. Подготовка 100 мл подвижной фазы растворителя, который гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота (H: Е: A; 80:20:2 об / об / об). Налейте растворитель в камеру, чтобы дать глубину около 1 см. Покрытие с стеклянной крышкой, с помощью силиконовой смазки уплотнения вдоль верхнего края камеры. Разрешить камера уравновешиваться в течение ночи перед использованием. Применение образца вручную на подготовленную пластины с капиллярной трубкой или пипетки в качестве непрерывной полосы от примерно 1,5 см от одного края до 1,5 см до другого края. Автоматизированная образец аппликатор является предпочтительным, так как он будет загрузить образец в более однородной полосу. Используйте внешние переулков ТСХ пластины обнаружить около 20 мкл смеси стеролом, FFAs, теги и стандарты стериновый эфир (использование в дозе 10 мг / мл; предварительно сделанные смеси могут быть получены). Поместите загруженный пластинки ТСХ вуравновешивали камера, рядом с крышкой, а также разработать тарелку, пока растворителя не работает по верхнему краю. Это займет около 45 мин с подвижной фазы, описанной здесь. Снять пластину из камеры и позволяют избыток растворителя испаряется из пластины в вытяжной шкаф в течение примерно 1 мин. Спрей с 0,05% родамина 6G в 95% этанола. Визуализация липидов полосы под длинным длин волн ультрафиолетовой лампы. Марк с карандашом R позиция е для флуоресцентных полос разрешенных в образце и стандартов. Фотографическая запись может быть принято в этой точке. Определить полосу, соответствующую стандарту TAG и удалить его из пластины путем соскоба кремния от шпателем на большой кусок пергамин взвешивания бумагу. Трансфер кремния в 1,5 мл растворителя промывали трубки микроцентрифужных. Добавить 1,0 мл 3:02 C: M растворитель в пробирку, гомогенат течение 1 мин, гранулы кремнезема центрифугированием, а затем передать растворитель в новую предварительно взвешенную пробирку. Повторите йэ предыдущий шаг, объединить фильтратов, и растворитель выпаривают в токе N 2. Храните высушенный остаток, содержащий тэгов под N 2 в темноте при температуре 4 ° С в то время как дополнительные образцы ткани разделяются TLC. Родамина 6G присутствует в образцах, но нерастворим в гексане и удаляется во время растворения образца непосредственно перед МС-анализ. 3. Анализ TAG на MALDI-TOF MS Подготовьте свежий α-циано-4-гидрокси-коричной кислоты (CHCA) матричный раствор путем растворения 10 мг CHCA в 1 мл растворителя (49,5% этанола, 49,5% ацетонитрила и 1% водного 0,1% TFA). Подготовка adrenocarticotropic гормона (АКТГ; 18-39 клип, 2465,1989 DA) для разрешения приборов и теста на чувствительность путем смешивания 1 мкл АКТГ (1 мг / мл) с 39,5 мкл 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) с получением 10 пмоль / мкл раствор. Это можно хранить при -20 ° С для последующего использования. Готовят свежую рабочую АКТГ Solutион (1 пмоль / мкл), принимая 1 мкл 10 пмоль / мкл исходного раствора, смешение с 9 мкл 0,1% TFA, и затем смешивание (1:1) с 10 мкл раствора матрицы CHCA, чтобы получить 500 фмоль / мкл концентрации. Подготовка стандартов TAG в дозе 10 мг / мл в 3:02 C: М для калибровки MALDI приборной (например tricaprin [470,361 Da], трикаприлин [554,455 Da], трилаурин [638,549 Da], трипальмитин [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , тримиристин [806,736 Da], триолеин [884,783 Da], три-11-eicosenoin [968,877 Da], и trierucin [1052,971 Да]). Подготовка триолеин в дозе 10 мг / мл в 3:02 C: M для внешнего блокировки масса калибровочного стандарта TAG. Растворите сохраненные образцы тег в гексан, раствора 10 мг / мл. Подготовить 0,5 М (77,06 mg/1.0 мл) исходного раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) с 90% метанола для использования в качестве образца и стандартной матрицы. Кроме подготовить 1,0 М (2,0 g/50.0 мл) раствор NaOH. Накройте трубку с DHB решения с использованием алюминиевой фол л для защиты от света. Mix (в предварительно вымытых трубок) 10,0 мкл DHB матрица, 10,0 мкл образца или стандарта, и 5,0 мкл 1,0 М NaOH. Смешать и кратко центрифуги трубки довести смесь до дна. Пятно 1,0 мкл стандарта, образца или АКТГ на MALDI нержавеющей стали целевой пластины и место в эксикаторе до сухой. Поместите мишень в прибор для сбора данных. Выполните MALDI-TOF масс-спектрального анализа в положительном режиме рефлектрон. Настройка и откалибровать прибор, как описано производителем инструмента с помощью АКТГ и TAG стандартные решения. Приобретать спектры для каждого образца наносили на цели (в соответствии с спецификации приборов; параметры для этой работы были 5 Гц лазер скорострельность, ~ 100 выстрелов в месте, чтобы получить среднюю спектр). После сглаживания и вычитания фона от MALDI спектров, процесс ионные пики вручную с помощью онлайн поисковых систем липидных MAPS (/ Инструменты / мс / glycerolipids_batch "целевых =" _blank "> www.lipidmaps.org / инструменты / мс / glycerolipids_batch). Скопируйте и вставьте спектры список в список предшествующих ионов и коробки интенсивности. Ограничить поиск композиции ацил желаемого. Определить тэгов массовой / заряда (м / г) соотношениях от ионов, присутствующих в спектре для каждого образца. Если метил жирной кислоты (FAME) проценты можно получить отдельный анализ ГХ / МС, добавить эти данные для получения вероятности тэгов присутствующих. ИНСТРУМЕНТ: Масс-спектрометр используется в данном исследовании является Воды MALDI Micro MX (оснащен нм 20 Гц N 2-лазера на 337). Любого производителя MALDI инструмент с положительной возможностью режима рефлектрон могут быть использованы. Общие настройки используются импульс напряжения, 2000 В; рефлектрон, 5200 В; источник, 15000 V, с приобретением данных с помощью программного обеспечения MassLynx (ст. 4.0). Эти условия эксплуатации обеспечивают разрешение по массе больше, чем 12000.

Representative Results

Способ экстракции для выделения общих липидов из ткани, описанной Folch 30 является простой процедурой, который приспособлен здесь. После экстракции тканей и выпаривания растворителя, липиды часто появляются в виде желтоватого пленки. Желтый цвет, скорее всего, от белковых примесей, которые могут быть удалены путем выполнения жидкостно-жидкостной экстракции. Эта дополнительная обработка образца не требуется в этой процедуре, поскольку препаративной ТСХ отделяет TAG фракции из таких примесей. Добавление свежего безводным сульфатом натрия на всех этапах фильтрации помогает уменьшить загрязнение воды, которая влияет точности измерения веса липида определения. Млекопитающих покровных липидов анализирует препаративной ТСХ с H: E: в качестве подвижной фазы, как правило, решить четыре различных полосы, соответствующие (начиная с происхождения) стерины, FFAs, теги и сложные эфиры стерина / восковые эфиры / сквален (рис. 1). В отдельных случаях при использовании анакал высокая производительность (HP) ТСХ с H: E: подвижной фазы, стериновый эфиров, восковых эфиров, и сквален отделит и появляются в виде трех отдельных полос. В условиях, применяемых в настоящем исследовании, стерол / восковые эфиры не разделены. Если эти полосы представляют интерес, подвижная фаза может быть переключена на изооктана: этиловый эфир (95:5 об / об), и ВЭТСХ пластина может быть проанализирована с помощью сканирующей денситометрии. Другие факторы могут вызвать плохое разделение. Они, как правило устранены путем размещения фильтровальную бумагу в камере, применяя смазку для плотного закрывания на крышке, уравновешивающая камеру на ночь, и держать чистые TLC камеры, чтобы получить неизменно высокое качество TLC разделения и данных. Представитель масс-спектры MALDI-TOF получены для тэгов, выделенных из Восточной красной битой показаны на рисунках 2 и 3. Эти спектры содержат TAG ионные пики в области масс между т / г 850 – 910, что является типичным для метки, изолированных от не-водное млекопитающеес. Добавление 1,0 М NaOH способствует однозарядных ионов Na +, которые являются более стабильными, чем ионов Н +. В дополнение к стабильности, отсутствие ионов + Н + и К увеличивает легкость спектрального анализа. М / з 850 – 910 ион пики соответствуют 16:00, 18:00, 18:01, и 18:02 FA фрагменты будучи доминирующими составляющими ацильные в тегах (табл. 1). Возможные FA фрагменты Метки могут быть изначально определяется общей ионный м / г настоящее время в MALDI-TOF MS спектров, и различия между видами и физических лиц, выведенных. Однако, если необходимы конкретные соотношения содержания ацил, то MS / MS или газовой хроматографии (GC / MS) должны быть использованы. Дополнительная информация о соотношениях ацильных можно вывести путем наблюдения пики в diacylglycerides области спектра (рис. 4). Diacylglycerides изготавливаются из TAG фрагментации в источнике MALDI и могут быть найдены в м / Z 590 – 650 области. Фрагментация TAG может быть увеличена путемопуская добавлением 1,0 М NaOH 16. Восточная красный крыло летучей мыши ткань характеризуется доминирующей пика в т / г 879,7 и волос ткани с доминирующей пика на т / г 881,8 (рис. 2 и 3 соответственно). Пики при т / г 907,8, 879,7 и 855,7 (POP, ОПП) примерно даже в интенсивности (~ 50%) в волос ткани с пиком в 853,7 существа ~ 40%. Состав Элементный состав Наблюдаемая масса Na + тега Na + тега SSO С 57 H 108 O 6 911,8 ООС, LSS С 57 H 106 O 6 909,8 ООО, LnSS, РБП С 57 H104 O 6 907,8 ЛОО, LLS С 57 H 102 O 6 905,8 LLO, OOLn С 57 H 100 O 6 903,7 LLL С 57 Н 98 О 6 901.7 LLLn С 57 Н 96 О 6 899,7 LLnLn С 57 Н 94 О 6 897,7 LnLnLn С 57 Н 92 О 6 895,7 OSP C 55 H 104 O 6 883,8 ЛСП, ООП, Софо C 55 H 102 O 6 881,8 ПОЛ, LnSP, LSPo C 55 H 100 O 6 </ TD> 879.7 ТОО, LNOP, Lopo C 55 H 98 O 6 877,7 LnLP, LLPo, LnOPo C 55 H 96 O 6 875,7 LnLnP, LnLPo C 55 H 94 O 6 873,7 LnLnPo C 55 H 92 O 6 871,7 PPS С 53 H 102 O 6 857,8 POP, ОПП С 53 H 100 O 6 855,7 ООМ, Закон о госзакупках, PoPoS, POPO С 53 Н 98 О 6 853,7 PPLN, PPoL, PoPoO, MyOO С 53 Н 96 О 6 851,7 Магистр права, LnOM С 53 Н 94 </sUB> O 6 849,7 ППС, SSLa С 51 Н 98 О 6 829,7 PPPO, OSLa С 51 Н 96 О 6 827,7 PPoPo, PMyO С 51 Н 94 О 6 825,7 LnLnLa С 51 Н 86 О 6 817,6 MMS, пощечина, PPM С 49 Н 94 О 6 801,7 SLaPo, PPOM, PPMy С 49 Н 92 О 6 799,7 PoPoM, OOCa С 49 Н 90 О 6 797,7 ММП С 47 H 90 O 6 773,7 ММПО, OCAP С 47 Н 88 О6 771,7 OCaPo С 47 Н 86 О 6 769,6 МММ, Управление рассмотрело, PMLa С 45 Н 86 О 6 745,6 PoPCa, PoMLa С 45 Н 84 О 6 743.6 Popoca С 45 Н 82 О 6 741,6 LaLaP, MMLa, MCAP С 43 Н 82 О 6 717,6 LaLaPo С 43 Н 80 О 6 715,6 О.О. С 39 Н 72 О 5 643.5 ПР С 39 Н 70 О 5 641.5 Л.Л. С 39 Н 68 О 5 639,5 SP С 37 Н 72 О 5 619.5 ОП С 37 Н 70 О 5 617,5 LP С 37 Н 68 О 5 615,5 Таблица 1. Состав жирных кислот, элементный состав, и изотопный масса sodiated аддуктов триацилглицеридов и diacylglycerides. Ln = линоленовая кислота (18:03), L = линолевая кислота (18:02), O = олеиновая кислота (18:01), S = стеариновая кислота (18:00), P = пальмитиновая кислота (16:00), Ро = пальмитолеиновая кислота (16:01), М = миристиновая (14:00), Мой = миристолеиновая кислоты (14:01) Ла = лауриновой кислоты (12:00), Са = Capric кислоты (10:00). Рисунок 1. Тонкослойная хроматограмма разделения широкого класса липидов по гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота(80:20:2 об / об / об) в качестве подвижной фазы. Полоса между стерола и FFA не был определен стандартом, но может быть жирный спирт или сложный диэфир воск. Рисунок 2. Расширенное TAG область MALDI-TOF масс-спектре sodiated тэгов. (М / з 700 – 950) из Восточной красной летучей мыши (L. Borealis) крыло ткани Пикс, определенные на т / г 853,7 (ООМ, Закон о госзакупках, PoPoS, POPO) и м / г 879,7 (ЛОП, LnSP, LSPo). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 3. Расширенное TAG область MALDI-TOF масс-спектре sodiated метки (м / з 700 – 950) из Восточной красной летучей мыши (L. Borealis) волосы ткани.Пики, идентифицированные в т / г 905,8 (ЛОО, LLS) и т / г 907,8 (ООО, LnSS, ЛСО). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 4. ДАГ область MALDI-TOF масс-спектре sodiated фрагментов DAG (м / з 530 – 730). Из Восточной красной летучей мыши (L. сияние) крыло ткани Пикс, определенные на т / г 643,5 (ОО) и м / г 615,5 (LP) . Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Эта статья представляет собой простой и надежный способ отделения широкие классы липидов, выделенных из кожного покрова млекопитающих препаративной ТСХ и определения профилей TAG на MALDI-TOF MS, без затрат времени производных из липидных молекул. Критические шаги в производстве качественного спектры тегов с MALDI-TOF MS включают: 1) успешного извлечения соединения с минимальным загрязнением или окисления, 2) достаточное разделение и изоляцию с помощью хроматографии и 3) Высокое разрешение и масс точность по MALDI-TOF МС.

Эта статья демонстрирует способ путем извлечения и разделения нейтральную липидной фракции из plagiopatagium Восточного красного летучей мыши, чтобы получить TAG MS профили. Хотя настоящее исследование использовало летучая мышь видов (Mammalia: Chiroptera) эти методы могут быть расширены для изучения покровных липиды любых видов млекопитающих. Бат покров характеризуется тем, что в основном холестерин, с меньшими количествами тэгов, FFAs, SquaLene и стериновый / восковые эфиры. Отношения Кожное сало липидов в летучих мышей отличаются от людей в этом сквален присутствует в небольших количествах (в отличие от до 16% у людей), в то время как уровень холестерина происходит в больших соотношениях (1 – 7% у людей, но 26 – 62% у летучих мышей) 22 , 31. Человека волосы содержат около 3% Метки, в то время как отношения до 28% находятся в Восточной волос красный битой. Экстракцию липидов из образцов с битами аналогично для других видов. Хотя в данном исследовании, ватные шарики, пропитанные растворителем используются для удаления кожного сала, также можно инвертировать флакона или пробирку, содержащую растворитель, на поверхность покровов несколько раз. Специализированный пленочные изделия также обеспечить альтернативные средства для извлечения поверхности липидов 32. Важной частью надлежащего экстракции липидов является сведение к минимуму загрязнения с кожи масла. Это легко сделать, сохраняя бутылку сжать метанолом и распыления все стекла и посуду, вытирая посуду с тканью между всеми образцами и носить перчатки. Окисление ое полиненасыщенные ацилы предотвращается путем добавления ВНТ, и она должна быть использована независимо от температуры образцы хранятся в.

Анализ Биомолекулы обычно требует хроматографического шаг к отдельных молекул, представляющих интерес от загрязнений. ТСХ используется в этом методе, что позволяет избежать требования измерительная аппаратура для газовой или жидкостной хроматографии и требует меньше технического опыта для достижения надежных и воспроизводимых результатов. В зависимости от липидного класса интереса многие различные подвижные фазы могут быть включены. Кроме того, использование ВЭТСХ-пластинах и сканирующей денситометрии могут быть использованы для достижения количественных результатов. В то время как варианты ТСХ методов слишком много, чтобы перечислить здесь, некоторые общие подвижные фазы, используемые в липидной ТСХ включают хлороформ: метанол: вода для разделения фосфолипидов и гликолипидов или изооктан: этиловый эфир для разделения неполярных липидов 28. С точки зрения разделения тегов из других классов липидов, Н: E: такlvent система работает стабильно и обеспечивает сопоставимые результаты.

Еще одно преимущество для использования TLC является то, что полосы интерес, могут быть быстро профилированные с помощью MALDI-TOF MS без предварительного дериватизации аналитов. В этом исследовании кремнезем извлекают из ТСХ пластине, и аналит элюировали из нее ультразвуком в растворителе и последующей центрифугирования для отделения адсорбента и испарение элюирующего растворителя. Кроме того, матрица может быть нанесен непосредственно на анализируемых полос, разделенных на пластинах ТСХ и затем непосредственно анализировали с помощью MALDI-TOF MS 33. Успешное профилирование по MALDI-TOF MS действительно полагается на достаточном пробоподготовки и квалификации оператора с настройкой и калибровки прибора. Прибор должен быть откалиброван в день с стандартов в отношении молекулярной соответствующий диапазон веса для молекул, представляющих интерес. Подходит чувствительность и разрешение (например, ≥ 10000) оборудования также должны быть confirmeг в день с АКТГ.

Сальные липидные компоненты, найденные на поверхности кожного покрова млекопитающих может играть определенную роль в колонизации бактериальными / грибковых патогенов. Поэтому знание химического состава среди видов и особей может содержать сведения о процессах на человека и животных заболеваний. Внутривидовые различия между больными и здоровыми лицами может представлять клинические признаки, которые помогают в обнаружении заболеваний и диагностики. Кроме того, если конкретные соединения, которые ингибируют рост микроорганизмов присутствуют, то они могут быть определены для использования в лечении и профилактике заболеваний.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Помощь была оказана Скотт Трис, Katelyn Arter, Джереми Ragsdell, Тони Ламарк Джеймс, Эми Фишер, Ханна Блэр, и Шайенн Gerdes при разработке лабораторных методов. Мы хотели бы поблагодарить Медина-Боливар лаборатория (Луис Х. NOPO-Olazabal; Арканзас Biosciences институт) за помощь в ТСХ сканирования денситометрии. MALDI-TOF MS используется для данного проекта была осуществлена ​​через NSF EPSCoR, НИИГ: Арканзас АКТИВАМИ Инициатива P3 Center (EPS-0701890) в Институте Арканзас Biosciences. Финансирование было предоставлено через рыболовства США и охотничьего хозяйства / штата Арканзас дикой природы Грант, Национального Спелеологического общества, и центр для североамериканского Бат исследованию и сохранению в Университете штата.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg
Sebutape CuDerm S100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today’s pre-clinical data into tomorrow’s daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. . Principles of Biochemistry. , (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P., Lorence, A. . Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. , (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R., Cole, R. B. . Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. , 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption – ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

TriacylglyceridesSebumLipid CompositionThin-layer ChromatographyMALDI-TOF Mass SpectrometryMammalian IntegumentInnate Immune SystemSkin Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image