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化学

A Materiales guiada criterio de selección para el desarrollo cuantitativas sol-gel microarrays de proteínas derivadas

Published: August 26, 2013
doi:
10.3791/50689
,
1Department of Chemistry and Chemical Biology,McMaster University

Summary

Se describe un método de detección de material guiada para desarrollar sol-gel dopados con microarrays de proteínas derivadas utilizando un método de pin-impresión emergente de fabricación. Esta metodología se demuestra a través del desarrollo de la acetilcolinesterasa y multicinasa microarrays, que se utilizan para la detección de molécula pequeña rentable.

Abstract

Microarrays han encontrado su uso en el desarrollo de ensayos de alto rendimiento de nuevos materiales y el descubrimiento de los cables de drogas de moléculas pequeñas. Aquí se describe un método de detección de material guiada para identificar materiales a base de sol-gel que son adecuados para la producción de tres dimensiones microarrays de proteínas. El enfoque identifica primero los materiales que se pueden imprimir como microarrays, se estrecha hacia abajo el número de materiales mediante la identificación de aquellos que son compatibles con un ensayo de enzima dada, y luego en piedras de afilar en materiales óptimos sobre la base de la retención de la actividad enzimática máxima. Este enfoque se aplica para desarrollar micromatrices adecuados para dos ensayos de enzimas diferentes, uno utilizando la acetilcolinesterasa y la otra usando un conjunto de cuatro quinasas clave implicados en el cáncer. En cada caso, era posible producir micromatrices que podrían ser utilizados para ensayos de cribado de moléculas pequeñas cuantitativos y la producción de curvas de respuesta a inhibidores dependientes de la dosis. Es importante destacar que la capacidad de cribar muchos compañeroriales producen información sobre los tipos de materiales que mejor se adapten tanto la producción de microarrays y la retención de la actividad enzimática. Los datos de los materiales proporcionan una idea de las necesidades de material de base necesarias para la adaptación óptima microarrays derivados de sol-gel de alta densidad.

Introduction

Microarrays han ganado popularidad dentro de la comunidad científica como un método para aumentar el rendimiento del ensayo. Desde el desarrollo de la tecnología de microarrays para evaluar la expresión de genes 1 a mediados de la década de 1990, los microarrays han encontrado uso en el desarrollo de ensayos de alto rendimiento para identificar la proteína-proteína y proteína-interacciones de moléculas pequeñas, y para encontrar nuevos materiales con propiedades únicas. 2-5 Más recientemente, se han desarrollado micromatrices de materiales específicos en el que se utilizan para inmovilizar proteínas funcionales, la producción de un elemento de microarrays de tres dimensiones en el que se atrapan las proteínas, lo que permite la medición fácil de la actividad enzimática y la inhibición en el propio microarray utilizando una fluorescencia adecuado ensayo que está acoplado a la rotación de sustrato. 5-10 Es importante destacar que, tales micromatrices pueden ser diseñados para incluir todos los componentes necesarios para seleccionar las muestras y los controles juntos de una manera altamente paralelo. 5,8 </ P>

Los primeros ejemplos de microarrays de proteínas se preparan típicamente utilizando métodos estándar para la inmovilización de proteínas sobre soportes sólidos, tales como unión covalente, 11 afinidad de captura 3 y adsorción física. 12 Si bien estos métodos de bio-inmovilización permiten un aumento de la concentración de la muestra y la cinética de reacción acelerada requerido para miniaturización ensayo, cada uno de ellos sufren inconvenientes. En general, todos causan una reducción de la funcionalidad biomolécula nativa debido a una modificación química de la superficie, dificultado el acceso a los sitios activos, o la orientación incorrecta debido a la inmovilización no específica. Por lo tanto, todos los métodos dan lugar a la sensibilidad del ensayo menor a pesar de un aumento en la deposición de biomolécula, una respuesta que probablemente surge debido a la necesidad de unir artificialmente biomoléculas a una superficie.

Un enfoque emergente para la producción de micromatrices de biomoléculas funcionales es a través del pin-impresión de la proteína-dopadosoles de sílice sobre soportes sólidos, que son típicamente portaobjetos de vidrio o bien funcionalizados o pocillos individuales de placas de micropocillos. El proceso sol-gel en sí se lleva a cabo en un medio acuoso a temperatura ambiente, y que es el precursor líquido que se imprime y luego los geles a biomoléculas atrapan dentro de la matriz 3D, lo que permite alta carga de proteína 13 así como atrapamiento de múltiples componentes dentro de el mismo elemento de microarrays. 13,14 de costura en el material derivado de sol-gel se puede hacer a través de una cuidadosa selección de diferentes precursores de sílice, así como mediante la alteración de la componente acuoso a través del uso de diferentes tampones (pH, fuerza iónica), y la inclusión de los diversos aditivos (polímeros, moléculas pequeñas) para lograr un material óptimo, la naturaleza específica de los cuales depende de la biomolécula que está atrapado. 10

Una limitación potencial asociado con el desarrollo de sol-gel derivadas microarrays de proteínas a través del pin de impresión esla necesidad de identificar los materiales compuestos basados ​​en sol-gel que se pueden imprimir sin gelificante en la clavija o mostrar propiedades indeseables (tamaños irreproducibles punto, grietas, falta de adherencia, la incompatibilidad con los componentes del ensayo, la actividad de la proteína deficiente) una vez impresas en una superficie. 5 Simultánea optimización de todos estos parámetros se opone a un enfoque en el que los materiales se pueden diseñar de novo, o examinó lentamente de una manera en serie. Por otro lado, la selección aleatoria de muchos miles o decenas de miles de materiales no es ni de tiempo ni rentable.

En este artículo se describe un método de detección ordenado que permite una rápida identificación de los materiales adecuados para la producción de microarrays de proteínas sin la necesidad de defender al azar una gran cantidad de materiales. Utilizando un enfoque de guiado, los materiales adecuados para la impresión de microarrays se identificó por primera vez, seguida de una serie de pantallas de pequeña escala para identificar óptima de sol-gel deriva materialescombinaciones al que se pueden imprimir reproducible, sin agrietarse y son compatibles con un ensayo dado. Por último, se identifican los materiales óptimos sobre la base de la retención de la actividad de la enzima y el rendimiento en un ensayo de cribado de pequeña molécula final. De esta manera, los materiales óptimos pueden ser identificados a partir de muchos miles de candidatos utilizando sólo unos pocos cientos de pasos del ensayo. Demostramos este enfoque para la fabricación tanto de la acetilcolinesterasa de alta densidad y microarrays de multicinasa y el uso de tales microarrays para la detección de molécula pequeña.

Protocol

1. Preparación de las soluciones de aditivos Preparar mM de Tris (hidroximetil) aminometano 25 y 50 (base Tris, M r 121,14 g / mol) y HEPES (M r 238,3 g / mol) a un pH de 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 y 8,2 en 50 ml de centrífuga tubos. Ajustar el pH con HCl 1 N y NaOH, respectivamente. Guarde a temperatura ambiente y reemplazar a los 3 meses. Preparar 24% (w / v) de poli (alcohol vinílico) (PVA): se pesan 2,4 g de PVA (M w 9000 – 10000, 80% hidrolizado) y añadir a 10 ml de agua desionizada destilada (ddH2O), disolver los gránulos de polímero por agitación en vórtex. Utilice la solución 24% (w / v) para preparar volúmenes iguales de 16% (w / v), 12% (w / v) y 8% (w / v) de soluciones de PVA. Soluciones desgasifica mediante sonicación antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. Preparar 24% (w / v) de polietileno imina (PEI): añadir 4,8 ml de PEI (M w 1300, 50% (w / w) en H2O) a 5,2 ml de ddH 2 O. Utilice la solución 24% (w / v) para preparar volúmenes igualesde 16% (w / v), 12% (w / v) y 8% (w / v) de soluciones de PEI. Soluciones desgasifica mediante sonicación antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. Preparar 60% (w / v) de polietilenglicol (PEG): se pesan 6 g de PEG (M W 600) y añadir a 10 ml de ddH 2 O, disolver los gránulos de polímero por agitación. Usa dilución en serie para preparar un volumen igual de 30% (w / v) de solución de PEG. Soluciones desgasifica mediante sonicación antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. Preparar 24% (v / v) de N-(3-trietoxisililpropil) gluconamida (GLS): añadir 480 l de GLS (50% en etanol – GLS de valores pueden requerir el uso de un baño de agua a calentar y disolver solución si es cristalina) a 520 l de 95% (v / v) de etanol y se mezcla durante 20 min por sonicación. Utilice la solución 24% (v / v) para hacer un volumen igual de 16% (v / v) de solución de GLS. Hacer nuevas soluciones para el uso por día. Preparar 24% (v / v) metiltrimetoxisilano (MTMS): añadir 240 l de MTMS a 760 l de ddH existentes se acidificó 2 O (pH 2,0, HCl 1 N) y se mezcla durante 20 min por sonificación. Utilice la solución 24% (v / v) para hacer un volumen igual de 16% (v / v) de solución MTMS. Hacer nuevas soluciones para el uso por día. Preparar 24% (v / v) bis [(3-methyldimethoxylsilyl) propil] óxido de polipropileno (MDSPPO): añadir 240 l de MDSPPO a 760 l de ddH existentes se acidificó 2 O (pH 2,0, HCl 1 N) y se mezcla durante 20 min por sonificación. Utilice la solución 24% (v / v) para hacer un volumen igual de 16% (v / v) de solución MDSPPO. Hacer nuevas soluciones para el uso por día. Preparar 24% (v / v) de 3 – (aminopropil)-trietoxisilano (APTES): añadir 240 l de APTES a 760 l de ddH existentes se acidificó 2 O (pH 2,0, HCl 1 N) y se mezcla durante 20 min por sonificación. Utilice la solución 24% (v / v) para hacer un volumen igual de 16% (v / v) APTES solución. Hacer nuevas soluciones para el uso por día. Preparar 24% (v / v) bis (triethoxysily) etano (bis-TEOS): añadir 240 l de bis-TEOS a 760 l de ddH existentes acidificada 2 O (pH 2,0, HCl 1 N) Y mezclar durante 20 min por sonificación. Utilice la solución 24% (v / v) para hacer un volumen igual de 16% (v / v) de solución de bis-TEOS. Hacer nuevas soluciones para el uso por día. Preparar 24% (v / v) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): añadir 960 l de Si-COOH (25% en ddH2O) a 40 l de ddH existentes se acidificó 2 O (pH 2,0, HCl 1 N) y se mezcla durante 20 min de sonicación. Utilice la solución 24% (v / v) para hacer un volumen igual de 16% (v / v) de solución de Si-COOH. Hacer nuevas soluciones para el uso por día. Por separado, preparar ε 3 mM de N – acetil-L-lisina, D-sorbitol, α-α-trehalosa (M r 188,22 g / mol, 182,17 g / mol, y 378,33 g / mol, respectivamente) y 1,5 mM, Triton X-100 (promedio M w 625 g / mol) en ddH 2 O. Los volúmenes pueden variar dependiendo de la cantidad que se requiere, hacer nuevas soluciones para el uso por día. Preparar 60% (w / w) de glicerol: añadir 2,4 g de glicerol anhidro a 1,6 g de ddH2O, mezcla por vórtice. Solución Degaspor sonicación antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. Preparar 30% (w / w) de glicerol: añadir 1,6 g de glicerol anhidro a 2,4 g de ddH2O, mezcla por vórtice. Solución desgasifica mediante sonicación antes de su uso. Almacenar a 4 ° C durante un máximo de 1 mes. 2. Preparación de soles de sílice Siguiendo los procedimientos indicados a continuación, los respectivos soles, cuando se mantienen en hielo, se pueden usar hasta 1 hora después de la adición de agua. Sols utilizados más allá de 1 hr resultado una disminución en los tiempos de gelificación materiales / inconsistentes. Preparación de un silicato de sodio (SS) basado sol Pesar 120 g de resina de intercambio iónico en un vaso de precipitados de plástico de 500 ml. Añadir 150 ml de HCl 0,1 N y se agita durante 1 h usando una barra de agitación magnética 2 pulgadas. Filtrar la solución con un embudo Büchner conectado al vacío. Poco a poco agregue ddH2O para lavar la resina filtrada hasta que el filtrado resultante es clara. Esto tarda aproximadamente 100ml de ddH 2 O. Recoger y almacenar la resina preparada en un recipiente de plástico a temperatura ambiente hasta por 1 mes. Pesar 2,59 g de silicato de sodio (SS, 27% ​​(w / w) de SiO 2, 10% (w / w) de NaOH) en un vaso de precipitados de plástico de 50 ml. Añadir 10 ml de ddH 2 O a la SS. Agitar suavemente a mano para mezclar la solución. Pesar 5,60 g de resina preparada en un vaso de precipitados de 50 ml de plástico por separado. Añadir a la solución de silicato de sodio y se mezcla durante 2 min utilizando una barra de agitación magnética de una pulgada. Se filtra la solución de la mezcla con un embudo Büchner conectado a un aspirador conectado a un grifo de agua. Usar una jeringa de plástico de 10 ml equipado con un filtro de membrana de 0,2 micras para filtrar la solución de sol. Esto produce un sol con 5,6% (w / w) de sílice conoce como SS en el texto más. Mantenga el sol en el hielo cuando no esté en uso. ½ SS: añadir 1 ml de preparado SS sol a 1 ml de ddH 2 O, mezcla de vórtice. Mantenga el sol en el hielo cuando no seutilizar. Preparación de un diglycerylsilane (DGS) basado sol Sintetizar la DGS como se describe en otro lugar. 15,16 Tienda DGS cristalinas en un desecador a temperatura ambiente hasta por 6 meses. Pesar aproximadamente 1 g de la DGS cristalinas. Use un mortero para moler la DGS a un polvo fino. Complete este paso lo más rápidamente posible para evitar la absorción de humedad del aire. Transferir cuidadosamente la DGS finamente molidas a un vial de centelleo de 20 ml vacío, se registra la masa (a una milésima parte de un gramo). Añadir ddH2O para producir un 0,5 g / ml DGS. Someter a ultrasonidos la DGS hidrolizadas en hielo durante 20 min, mezclar por vórtice durante 5 s cada 5 min. Durante días húmedos, la disolución completa de DGS puede requerir la adición de 10 l de HCl 1 N. Esto debe añadirse a la solución antes de la sonicación. Usar una jeringa de plástico de 3 ml equipada con una membrana de 0,2 micras-filtro para filtrar la solución de sol, la eliminación de partículas finas. Esto produce un sol con 5,0% (w / w) de sílice conoce como DGS en texto más. Mantenga el sol en el hielo cuando no esté en uso. ½ DGS: añadir 1 ml de la DGS sol preparado con 1 ml de ddH 2 O, mezcla de vórtice. Mantenga el sol en el hielo cuando no esté en uso. 3. Pre-selección para identificar los materiales imprimibles Un esquema generalizado que muestra las diferentes etapas del análisis factorial guiada utilizado para identificar los materiales de impresión se muestra en la Figura 1. Se recomienda un volumen de material total mínimo de 100 l. El uso de volúmenes más pequeños hace difícil visualizar gelificación material. Etapa 1: tampón y silano Añadir 50 l de tampón (25 y 50 mM de Tris o HEPES a pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) a un vial de centelleo de vidrio ml 2. Añadir 50 l de la sol adecuada (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) y la mezcla de vórtice de forma en-y-fuera de 10 smover el vial dentro y fuera del mezclador vortex. Conjunto de materiales para descansar a temperatura ambiente, el seguimiento del tiempo de gelificación material. El tiempo de gelificación se define como el punto en el que el material deja de fluir libremente al girar el vial a un ángulo de 45 °. Excluir las combinaciones de materiales con tiempos de gelificación de menos de 2,5 horas de posteriores etapas de selección de materiales. Etapa 2: tampón, silano y el polímero En una 2-ml vial de centelleo de vidrio, añadir 3,13 l de solución o bien 16% (w / v) u 8% (w / v) de PVA / PEI o 6,3 l de 30% (w / v) o 60% (w / v) de solución de PEG. Añadir 50 mM de HEPES (pH 8,0) para llevar el volumen combinado de 50 l, mezclar la solución por vórtice. Añadir 50 l de la sol adecuada (DGS, ½ DGS, SS, SS ½), la mezcla de la manera descrita en el paso 3.1.2. Excluir las combinaciones de materiales con tiempos de gelificación (tal como se define en el paso 3.1.3) menos de 2,5 horas de posteriores etapas de selección de materiales. Etapa 3: tampón, silano, polímero y organosilano En una 2-ml vial de centelleo de vidrio, añadir 3,13 l de solución de PVA o bien 16% (w / v) u 8% (w / v) o 6,3 l de 30% (w / v) o 60% (w / v) solución de PEG. Añadir 3,13 l de 16% (w / v) de organosilano (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH o APTES). Añadir 50 mM de HEPES (pH 8,0) para llevar el volumen combinado de 50 l, mezclar la solución por vórtice. Añadir 50 l de la sol adecuada (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) y la mezcla de la manera descrita en el paso 3.1.2. Excluir las combinaciones de materiales con tiempos de gelificación (tal como se define en el paso 3.1.3) menos de 2,5 horas de posteriores etapas de selección de materiales. Etapa 4: tampón, aditivo de silano, polímero, organosilano y de molécula pequeña En una 2-ml vial de centelleo de vidrio, añadir 2,08 l de solución de PVA o bien 24% (w / v) o 12% (w / v) o 6,3 l de 30% (w / v) o 60% (w / v) solución de PEG. Añadir2,08 l de 24% (w / v) de organosilano (GLS, Si-COOH). Añadir 2,08 l de la solución de molécula pequeña 3 mM (ε N – acetil-L-lisina, D-sorbitol, α-α-trehalosa) o 1,5 mM (Triton X-100). Añadir 50 mM de HEPES (pH 8,0) para llevar el volumen combinado de 50 l, mezclar la solución por vórtice. Añadir 50 l de la sol adecuada (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) y la mezcla de la manera descrita en el paso 3.1.2. Excluir las combinaciones de materiales con tiempos de gelificación (tal como se define en el paso 3.1.3) menos de 2,5 horas de posteriores etapas de la impresión. 4. Preparación de imprimir materiales de proteínas de dopados Los materiales identificados en el final de la etapa 3.4.6 se llevan adelante en los estudios de capacidad de impresión, con la enzima apropiada ahora está incluido en el sol. En todos los casos se indica a continuación solución acuosa, que contiene todos los componentes excepto para el silanose prepara en un pocillo, seguido de la adición del sol justo antes de la impresión. Para acomodar el uso de una placa de microtitulación-384, se utiliza un volumen de solución total de 50 l en lugar de 100 l. La acetilcolinesterasa (AChE) microarray Prepare una solución al 2 kU / ml de AChE en HEPES 50 mM (pH 8,0) después de la actividad de la enzima específica del lote (unidades de actividad por mg) la información facilitada por el fabricante. Enzima Alícuota 2 solución madre KU / ml a 5 l fracciones usando tubos de microcentrífuga de 500 l y se almacena a -20 ° C. 2 soluciones de KU / ml AChE permanecen estables durante un máximo de 4 meses cuando se almacena a -20 ° C. Preparar materiales de base mediante la combinación de la mitad de los volúmenes de polímeros correspondientes, organosilanos y aditivos de moléculas pequeñas identificadas hasta el paso 3.4.6 en una placa de microtitulación de 384 pocillos. Añadir 5 l de 2 kU / ml de AChE en 50 mM HEPES (pH 8,0). Uso de HEPES 50 mM (pH 8,0), llevar el combinadovolumen de bodega de 25 l de la mezcla con la pipeta la solución de arriba y abajo varias veces. Multiquinasa microarray Preparar soluciones de 100 ng / l quinasa (p38, MAPK2, EGFR, GSK-3β) en ddH 2 O después de la actividad (U / ml ó U / mg) y la información sobre la cantidad proporcionada por el fabricante. Guarde soluciones quinasa en alícuotas de 2 l a -80 ° C. Preparar quinasa sustratos (MBP, p (E 4 Y), GSM) a 5 mg / ml, 50 mg / ml o 300 mM en ddH 2 O, a raíz de la información sobre la cantidad proporcionada por el fabricante. Sustratos Almacenar en alícuotas de 2,5 l a -80 ° C. Preparar materiales de base mediante la combinación de la mitad de los volúmenes de polímeros correspondientes, organosilanos y aditivos de moléculas pequeñas identificadas hasta el paso 3.4.6 en una placa de microtitulación de 384 pocillos. A cada pocillo que contiene los materiales de base, añadir 2,5 l quinasa y 2 l de su respectivo sustrato (p38 y MBP, MAPK2 y MBP, EGFR y P (E 4 Y), GSK-3β y GSM) que preparan en los pasos 4.2.1 y 4.2.2, respectivamente. Con 50 mM HEPES (pH 7.4), llevar el volumen bien combinada para 25 l. Mezclar mediante pipeteo. 5. Formación Microarray En esta sección se explica el procedimiento detallado de los materiales de impresión en una sola superficie de deslizamiento. Para imprimir en múltiples superficies de deslizamiento modificados (amina, epoxi, aldehído y PMMA), este procedimiento se repite 4 veces. Formulario microarrays utilizando un robot pin-impresión por contacto equipado con una etapa XYZ. Utilice los pernos de la vaina ranurados de 100 m de diámetro para depositar los soles proteína dopados. Conjunto de humedad dentro de la cámara de impresión a 80-90%. Humedad <80% puede resultar en la evaporación y las incoherencias de la muestra en la impresión, debido a los pequeños volúmenes de deposición. Someter a ultrasonidos pasadores en ddH 2 O durante 15 min antes de la impresión y seco bajo una corriente de nitrógeno. Utilice una cleane tuberíar para eliminar la humedad residual del interior del soporte de pasador y colocarlo con cuidado el pasador del cabezal de impresión. Si no se retira la humedad residual puede obstaculizar el pasador se mueva libremente con el soporte, lo que resulta en manchas perdidas. Patrones de matriz de control a través del programa Pro Escritor Chip (CWP). Para cada muestra dentro de la placa de fuente de 384 pozos, 200 puntos (máximo número de puntos por absorción utilizando el pin vaina SMP3) se imprimen sobre una superficie modificada portaobjetos de vidrio. Comenzar el proceso de impresión a través del software. Conjunto de viajes en la dirección XY para 10 mm / s, y la velocidad de aproximación de la muestra (dirección Z) a 2 mm / s con un tiempo de carga de 2,5 seg muestra. Detenga la carrera a través de CWP. Baje el pasador en la muestra y añadir 25 l de la respectiva sol (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) al pozo mediante una pipeta. Mezclar la solución con un movimiento hacia arriba y hacia abajo pipeteo repetido 50 veces. Cuando se mezcla por pipeteado, reducir al mínimo la cantidad de aire incorporado en la solución. Las burbujas de aire prevenciónt completar la carga de la muestra en el pin. Comenzar el proceso de impresión a través de CWP, e imprimir la muestra sobre una superficie de deslizamiento. Detenga el proceso de impresión antes de cargar la muestra de la placa de fuente posterior también. Retire el pasador de impresión que utiliza un imán y colocar un limpiador de tuberías en el cabezal de impresión para evitar la acumulación de humedad en el cabezal de impresión. Enjuague el pin de impresión con ddH 2 O y ultrasonidos en limpio ddH2O durante 30 segundos. Secar el pasador de impresión bajo una corriente de nitrógeno y eliminar el limpiador de tuberías, la colocación de la clavija de nuevo en el cabezal de impresión. Comenzar impresión siguiendo los pasos 5.6 a 5.10, para todas las muestras que quedan dentro de la placa de origen. Hasta 12.000 puntos de 100 m de diámetro pueden ser depositados en una sola diapositiva. Este método también se puede aplicar a materiales de impresión en la parte inferior de los pozos dentro de una microplaca de 96 pocillos. Tras el archivo de calibración CWP, recalibrar el pin de impresión para garantizar la distance viajó por entre la deposición punto está por encima de la altura de la microplaca. Esto permite que el pasador para imprimir consistentemente a partir de un pozo a otro de una manera lineal sin dañar el pasador. Edad de la matriz durante un mínimo de 30 minutos y hasta 24 horas dentro de la cámara de impresión a 80-90% de humedad después de la finalización de todo el experimento impresión. 6. Ensayo de actividad de acetilcolinesterasa Preparación de muestras de control positivo (PC) Preparar 1 mM de yoduro de acetiltiocolina (Atch: M r 289,18 g / mol) en 4% de glicerol, 25 mM de Tris (pH 7,0) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Atch necesidades que estar preparado fresco antes de cada uso y el uso de un tampón a pH 7,0 como tampones de pH más altos causan autohidrólisis rápida, producir falsos positivos. El volumen final se puede variar en función del número de muestras (25 l por muestra). Añadir 0,14 l de 5 mM de BODIPY-FL-L-cistina a 25 l de 1 mM de ACTH en el pozo de un 384-microtitulación PLAte. Añadir 24,86 l 4% de glicerol, 25 mM de Tris (pH 7,0); mezcla pipeteando cuidadosamente para evitar la formación de burbujas en la solución. Inhibidores potenciales de la enzima se pueden incorporar en la solución de PC antes de llevar el volumen a 50 l con tampón. Preparación de muestras de control negativo (NC) Añadir 0,14 l de 5 mM de BODIPY-FL-L-cistina a 49,86 l de 4% de glicerol, 25 mM de Tris (pH 6,5) en el pocillo de una placa de microtitulación de 384. Mezclar mediante pipeteo. Sobreimpresión PC y soluciones NC Sobreimpresión los microarrays de edad siguientes pasos 5.1 a 5.10 (ignorando el paso 5.6) del Protocolo. Utilice los pernos de la vaina ranurados de 235 m de diámetro para depositar el PC y soluciones sobreimpresión NC. Esto asegura que la solución cubre el punto previamente depositado por completo. Matrices Edad en 80-90% de humedad durante 1 hora a temperatura ambiente. Debido a la autohidrólisis de ACTH, los tiempos de incubación más largos pueden provocar falsos positivos o aumento enenzima actividad. 7. Ensayo de actividad de quinasa Preparar 500 mM de solución de adenosina 5'-trifosfato (ATP) usando la acción de ATP (100 mM) se almacena a -20 ° C. Haga solución nueva para cada experimento y ajustar el volumen a la necesidad experimental: cada solución de impresión requiere 5 l. Preparar un cloruro de magnesio 100 mM (MgCl 2: M r 95.21 g / mol) solución madre en ddH 2 O. Control positivo (PC) Añadir 2,5 l de 100 mM de MgCl 2 y 5 l 500 mM de ATP para el pozo de una placa de microtitulación de 384. Llevar el volumen total de 50 l con HEPES 50 mM (pH 7,4) y mezclar con la pipeta. Inhibidores potenciales de la enzima se pueden incorporar en la solución de PC antes de llevar el volumen a 50 l con tampón. Control negativo (NC) Añadir 2,5 l de 100 mM MgCl 2 y 5 l ddH 2 O para el bienestar de un 384-mplaca icrotiter. Llevar el volumen total de 50 l con HEPES 50 mM (pH 7,4) y mezclar con la pipeta. Sobreimpresión PC y NC cofactores ensayo Siga el paso 6.3.1 del protocolo. Matrices Edad en 80-90% de humedad durante 2 horas a temperatura ambiente. Tinción de diapositivas Lugar impreso microarrays se desliza de forma individual en una placa de Petri con suficiente colorante (del kit) para cubrir toda la diapositiva. Agitar moderadamente (~ 200 rpm) durante 45 minutos utilizando un agitador de placas. Retire el portaobjetos con unas pinzas y colocar en una placa de Petri limpia con tampón de lavado (del kit). Agitar moderadamente (~ 200 rpm) durante 45 minutos utilizando un agitador de placas. Retire el portaobjetos con unas pinzas y girar en seco utilizando una microcentrífuga microarray escritorio convencional equipado con un soporte de diapositivas. 8. Microarray imágenes y análisis Imágenes Tenga en cuenta que el método de formación de imágenes será sESPECÍFICOS con el tipo de lector de matriz disponible. Para estos estudios, un Alpha Innotech NovaRay formador de imágenes con una fuente de luz blanca y el sistema de detección del CCD equipado con un 478 ± 17 nm de excitación y 538 ± 21 nm filtro de emisión para los microarrays de AChE, y 530 ± 40 nm de excitación y 614 ± 62 nm de emisión filtrar fue utilizado microarrays quinasa. Sistemas de láser confocal de barrido también se pueden utilizar para la lectura de las matrices, aunque los ajustes serán específicos para el instrumento. Coloque la diapositiva en el soporte de diapositivas con los puntos hacia arriba. Ajuste el número de secciones de vista previa (se recomienda un mínimo de 2, uno en cada extremo del portaobjetos de microscopio), resolución (se recomienda un mínimo de 4 micras) y la exposición (se recomienda automático) dentro del software de imágenes. Adquirir imagen de diapositiva y guardar como un archivo. "Tiff". Análisis Abrir imagen adquirida en ImageJ64 diapositiva. Haga clic en la herramienta de selección ovalada y medir laintensidad de la señal de cada punto con la opción medida en la ficha Analizar. Cuando la selección del área a medir, seleccione una región ligeramente más grande que el punto observado y de tamaño uniforme entre los puntos para reducir ImageJ subjetividad. Promedio de la intensidad de 25 puntos PC similares, dividido por la intensidad media de 25 puntos NC similares para obtener ratios de PC / NC para las composiciones de material individuales.

Representative Results

Mediante la realización de un análisis de factor de guiado para el material de pantalla, hemos sido capaces de minimizar el número de materiales probados de ~ 20.000 a unos pocos centenares que tuvo tiempos de gelificación adecuados para la impresión. Mediante la aplicación de una norma estricta que requiere tiempo de gelificación del material de 2,5 horas o más, nunca se imprimieron materiales que puedan obstruir los pins impresión o producir matrices irreproducibles. Los materiales imprimibles identificadas tener suficientes (> 2,5 hr) tiempos de gelificación se imprimieron en 4 diferentes superficies deslizantes de vidrio funcionalizadas. Con el fin de ser considerado "imprimir", el número máximo de puntos por volumen de absorción del pasador tuvo que ser impreso (SMP3 = 200). Las manchas también se evaluó la morfología del terreno para asegurar que no separación de fases agrietamiento o indeseables se había producido usando microscopía de campo claro sencilla como se muestra en la Figura 2. A partir de esta etapa de materiales imprimibles identificados, microarrays se producen con la AChE yquinasas incorporados en el componente acuoso tamponado. Materiales que eran compatibles con el procedimiento de ensayo (incluyendo el potencial sobreimpresión y el lavado o la tinción pasos) se identificaron mediante la observación de la retención de manchas de microarrays (sin grietas, pérdida de puntos o patrones inusuales de fluorescencia) y un control positivo (CP) con el control negativo (NC ) relación mayor que 1 como se observa a través de la imagen. Como esto era más o menos 50% de los materiales, una mayor proporción de PC / NC de 3 se utilizó para definir los materiales óptimos con retención de la actividad de la proteína. A través de este método, 26 materiales derivados de sol-gel que contienen materiales AChE y 2 que contienen quinasas cumplieron los criterios de> 3 PC / NC. Figura 3 y la Figura 4 muestran un desglose gráfica de los 5 pasos en pantalla guiadas materiales para la identificación de la AChE y quinasa óptima microarrays, respectivamente. Los ensayos también pueden ser validados a través de la generación de puntuación de un Z-17. </sup> Esto se hizo utilizando el material que produce la mayor proporción de PC / NC. Figura 5 muestra la trama de la Z 'obtiene mediante la comparación de la señal generada a partir de 200 puntos, 100 PC y 100 NC después de sobreimpresión el colorante indicador y el sustrato de la matriz de la AChE. El dolor y los arrays quinasa resultaron en las respectivas puntuaciones Z 'de 0,60 y 0,67, indicativo de un excelente ensayo. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, antes de validación de un ensayo, enzima, tinte, sustrato y cofactor de concentraciones en-matriz tenían que ser optimizado por la sobreimpresión de un intervalo de concentraciones de cada componente y la selección de la concentración que produce la señal más alta, como se describe en detalle en otra parte . 5 Para validar los ensayos, se obtuvieron datos cuantitativos de inhibición mediante inhibidores de la AChE conocidos y desconocidos, con resultados realizados por duplicado y se utiliza para producir lotes duplicados (Figura 6A) y las curvas de inhibición (Figuras 6B y 6C). <strong> Spots fueron sobreimpresas primero con mezclas de inhibidores de moléculas pequeñas biológicamente activas conocidas entonces con el tinte y el sustrato, y se incluyeron mezclas de control que contengan cualquiera de los inhibidores conocidos o no inhibidores. Parcelas duplicadas fueron generados para evaluar la actividad de la enzima, y ​​cualquier mezcla de los que dieron lugar a la actividad enzimática a menos de 25% se consideraron positivos para la inhibición. Son compuestos individuales de tales mezclas se ensayaron a continuación por duplicado para identificar la molécula pequeña específica (s) responsable de la inhibición. Una vez identificadas, estas moléculas pequeñas se utilizaron para generar curvas de inhibición cuantitativos para determinar los valores de IC50 y las constantes de inhibición. Resultados cualitativos similares fueron obtenidos utilizando la matriz multicinasa con un inhibidor de quinasa común, estaurosporina. Figura 7A y 7B muestran la imagen de microarrays e indican que las intensidades de la señal después de sobreimpresión y tinción de la multicinasaarray son los esperados para un control negativo (- ATP), control positivo (+ ATP) y el inhibidor conocido (+ ATP + inh). Para demostrar la capacidad de obtener datos cuantitativos de inhibición de los microarrays, un ensayo de inhibición dependiente de la concentración se hizo por una única quinasa. Como se muestra en las Figuras 8A y 8B, intensidad de la señal disminuye a medida que aumenta la concentración de inhibidor, y la respuesta sigue la curva de inhibición dependiente de la concentración esperada para el sistema p38α/MBP quinasa / sustrato. Figura 1. Esquemática general para el método de detección materiales guiada. Cada bloque representa un paso de la pantalla en orden secuencial. Los números de la izquierda representan el número total de los materiales preparados para el análisis. El uso de un tiempo de gelificación mayor que 2,5 h (materiales con tiempos de gelificación de menos de 2,5 hr are indica el ponche), el número de materiales que pasaban cada etapa y llevado adelante durante la pantalla de materiales se indican con el número de la derecha. * Representa materiales con menos de separación de fases óptima. Figura 2. Las imágenes ópticas que muestran varios modos de fallo de los materiales en el paso de impresión de la pantalla. Una imagen de un material de "buena" (segunda fila, tercera columna) se muestra también para comparación. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. Figura 3. Un método de detección de material dirigido a la identificación de los materiales óptimos para la fabricación de sol-gel derivadas de microarrays AChE. Reproducido con permisión de referencia 5, copyright 2013 American Chemical Society. La Figura 4. Un material dirigido criterio de selección para la identificación de los materiales óptimos para la fabricación de microarrays de sol-gel derivadas de quinasa. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. Figura 5. (A) Una sección de microarrays AChE muestran HC (verde brillante) y LC (verde claro) puntos (una paleta de negro-verde se aplicó como pseudocolor de claridad en la presentación), (B) una vista ampliada de la zona de caja para resaltar lugar morfología y la alineación;., y (C) un Z 'trama líneas continuas indican la media de la repeticiones, mientras que las líneas discontinuas corresponden a 3SD. Reproducido con el permiso de referencia 5, copyright 2013 American Chemical Society. La Figura 6. (A) Duplicado parcela para el cribado en-matriz de análogos sintéticos de alcaloides de Amaryllidaceae, (B) IC 50 parcelas de inhibidores potenciales identificados como compuestos marcados 1 y (C) compuestos 2, con barras de error representan una desviación estándar de la media de 25 repeticiones. puntos representativos se muestran para ilustrar las diferencias en la señal proporcional a las concentraciones de inhibidor. Reproducido con el permiso de referencia 5, copyright 2013 American Chemical Society. Haz clic aquí para ver más grande la figura . nt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 7. El ensayo de matriz de cuatro quinasas utilizando 1.4SS/1.0PVA de atrapamiento e impresas sobre una rampa de amina-derivatizado. (A) Una imagen de una sección de microarrays en el que los puntos con quinasas co-atrapadas con sus respectivos sustratos se sobreimprimen con tampón (NC, fila superior), o soluciones que contienen ATP (PC, fila del medio) o ATP + estaurosporina (fila inferior). (B) Los gráficos de barras que comparan las intensidades de señal entre inhibidas y las reacciones no inhibidas, después de la sustracción de las señales de fondo y las barras de error representan una desviación estándar de la media de 25 repeticiones. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. Figura 8. Inhibiti. en el ensayo en un microarray p38a/MBP (A) Secciones de microarrays que muestran puntos representativos overspotted con concentraciones variables de estaurosporina, como se indica (las imágenes se obtuvieron por una sola exploración de la misma diapositiva, la imagen compuesta se muestra para mayor claridad). (B) IC 50 curva generada a partir de las imágenes de matriz analizados. La intensidad obtenido en 100 mM se restó de todas las imágenes; todos los demás intensidades se normalizaron mediante el establecimiento de la intensidad obtenida en 10 nM a un valor de 100% de actividad. Reproducido con el permiso de referencia 8, copyright 2013 American Chemical Society. La Figura 9. Imágenes de pin stealth microscópica utilizarse en contacto pin-impresión muestra varias imperfecciones: (A) obstruido, (B) doblados.

Discussion

La metodología descrita aquí fue seleccionado como el más adecuado para la identificación de los materiales derivados de sol-gel para imprimir con una impresora de contacto, produciendo un tiempo-y el procedimiento rentable para la rápida identificación de los materiales óptimos sin tener que cribar un gran número de materiales. De un total de ~ 20.000 materiales potenciales, era posible identificar ~ 200 materiales que eran adecuados para la impresión sobre la base de tiempo de gelificación solo. Esto reduce de manera significativa el número de materiales necesarios para estar preparados para los ensayos de impresión posteriores. Estos materiales imprimibles a continuación, se imprimieron en 4 superficies de deslizamiento para un total de 768 combinaciones de material de diapositivas. En promedio, 50 puntos / replica de un material se puede imprimir en aproximadamente 3 minutos, incluyendo la carga de la muestra, la deposición de punto y limpieza pin. De ellos, 155 materiales, o más o menos 20%, se permite imprimir el número máximo de puntos por la absorción de solución y producen tamaños de punto reproducibles. Cabe señalar que de la 4 slsuperficies ide probados, materiales impresos mejor en el orden: amina> epoxi> aldehído> PMMA, PMMA diapositivas no produjeron matrices útiles para cualquier material. Esto se atribuye probablemente a la polaridad de la superficie de recubrimiento. La comparación de las superficies de deslizamiento antes mencionados, la amina más polar y epoxi se adaptan mejor para los soles acuosos en comparación con las diapositivas de PMMA. Por otra parte, de las superficies ensayadas, los portaobjetos recubiertos de amina proporcionan una superficie de potencial cargado positivamente para el depositado aniónico sol para unir. Nosotros sospechamos, la nanopartículas de sílice en la interfaz entre la corredera y el sol de interactuar a lo largo de la superficie. Tanto el epoxi y las superficies de deslizamiento aldehído carecen de la misma interacción de carga basado en inicial. Para garantizar la deposición óptima lugar es muy recomendable utilizar diapositivas pre-recubiertos de un proveedor como Arrayit. Recubrimiento en la casa produce superficies inconsistentes que conducen a la mala reproducibilidad punto 13 y, en algunos casos, puede conducir a problemas de cuantificaciónblemas. 18 De igual importancia, la temperatura y la humedad afectan a la "impresión" de los materiales. Si bien no se realizaron estudios detallados sobre los efectos relacionados con la temperatura, la impresión siempre se llevó a cabo a temperatura ambiente (23 ± 3 ° C). Humedad (mayor que 80%) también se controla dentro de la cámara de impresión para evitar la deposición de forma irregular debido a la deposición de pequeños volúmenes (0,7-2,3 nl) y la evaporación.

Mientras la pantalla del material fue guiada hacia la identificación de los materiales derivados de sol-gel óptimas específicamente para la impresión de la AChE y quinasas, un pequeño conjunto de materiales fueron identificados que trabajó para ambos tipos de proteínas. En efecto, tanto de los materiales que fueron identificados para la fabricación de microarrays quinasa se basaron en SS + PVA + glicerol, y ambos materiales también fueron identificados dentro de los 26 materiales seleccionados para microarrays de AChE. Estos materiales "óptimas" pueden ofrecer un punto de partida para el desarrollo de genéricos más proteen dopados con microarrays de base de sol-gel, y las pantallas pequeñas centradas alrededor de estas composiciones pueden identificar incluso mejores materiales para la fabricación de microarrays. Un segundo punto a destacar es la importancia de la enzima utilizada. En el caso de la AChE (una enzima en lugar robustos), 26 (o más o menos 40%) de los 66 materiales originales identificados como compatibles-ensayo retenido la actividad de la AChE atrapado. Sin embargo, para los más delicados quinasas, sólo 2 de las 69 composiciones con capacidad para un ensayo, o más o menos 3% de los materiales, fueron capaces de retener la actividad de todas las quinasas. Mientras que un número suficiente de diferentes enzimas no se han estudiado a hacer declaraciones concluyentes, parece que la fabricación de gran variedad de optimización con las enzimas relativamente inestable puede conducir a la identificación de materiales que pueden atrapar una gran variedad de proteínas para permitir mutliplexed microarray fabricación.

Independiente de la proteína elegida, el factor de corte importante para la identificación de los materiales de impresión era la necesidad de un largotiempos de gelificación de los materiales (> 2,5 horas). Cuando el desarrollo de materiales de sol-gel a base de SS, es muy importante asegurarse de que, a raíz de intercambio iónico y filtración, el sol es a aproximadamente pH 4. Sols con un pH inicial más baja puede dar lugar a materiales con un pH por debajo de lo neutro, lo que puede afectar a la actividad enzimática. 19 Ajuste de la cantidad de Dowex (resina de intercambio iónico) a la SS puede alterar el pH final de la sol. Cuando se prepara un nuevo lote de la resina de la relación de resina a SS necesita ser ajustada con el fin de producir soles a aproximadamente pH 4 siguiendo el procedimiento en la sección 2 del protocolo.

Del mismo modo, la preparación de DGS cristalinas es a menudo una fuente de error asociado con la falla del material cuando se utiliza DGS soles basados ​​para el atrapamiento biomolécula. Aunque no se informó en detalle, el gran cuidado debe ser tomado durante la síntesis de DGS cristalinas, en particular, la necesidad de evitar la presencia de agua durante la síntesis, que puede producir sílice polyglyceratedTES en lugar de DGS monoméricas. También, debido a la naturaleza higroscópica de DGS, la muestra cristalina necesita ser almacenado desecado y utilizarse dentro de 6 meses después de la síntesis. DGS cristalinos mayores de 6 meses no pueden disolverse completamente (debido al material de silicato de poliglicerol parcialmente condensado) incluso con sonicación en un ambiente ácido. DGS incompleta disolución produce soles con contenido de sílice desconocido e incontrolable y por lo tanto, los materiales menos robustos.

Un punto importante a destacar con impresión por contacto es la calidad de los pasadores. Pines dañados o mal manejo (Figura 9) nunca se producen matrices reproducibles independientes del material que se imprime. Se recomienda comprobar la calidad de pin utilizando un microscopio de disección para garantizar pins roto u obstruido no se utilizan. El manejo cuidadoso asegura una larga vida de los pines. Libre circulación de la espiga es también importante. En los casos en que la humedad es atrapada en el cabezal de impresión entre la cabeza y el pasador, el pasadorno asiento correctamente y por lo tanto no va a hacer buen contacto con la superficie, lo que resulta en una falta de deposición de material.

En conclusión, hemos aportado un enfoque de estudio detallado, de múltiples etapas para el desarrollo de proteínas de alta densidad de microarrays dopados pin-impresas. La selección implica la optimización de las propiedades del material (tiempo de gelificación y capacidad de impresión) para permitir la impresión de los materiales, seguida por el cribado más centrado para identificar materiales que son compatibles con un ensayo dado y capaz de retener la actividad enzimática. Este enfoque de detección de material guiada puede aplicarse a formatos de microarrays adicionales para reducir el tiempo y costo asociado con la producción eficiente de alta densidad de microarrays.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge y Laura Lautens para la asistencia en el desarrollo de microarrays de la proteína. Los autores también agradecen a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) por financiar este trabajo. Los autores también agradecen a la Fundación Canadiense para la Innovación y la Innovación Confianza Ontario para apoyar este trabajo. JDB titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en Química bioanalíticos y Biointerfaces.

Materials

Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50% (w/w) solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0
Glycerol Sigma-Alderich 49767
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563
HEPES Sigma-Alderich H3375
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3
Stealth pin ArrayIt SMP7
Amine coated slides ArrayIt SMM2
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2
Exposy coated slides ArrayIt SME2
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612
Equipment
Virtek Contact Printer BioRad
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

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References

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Helka, B., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).
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