量<em在体外</em>激活的主人微血管内皮细胞在静态条件下测量的检测，以中性粒细胞粘附

由于血管内皮细胞在循环血液直接接触，它是唯一位于启动一个快速的在感染或损伤的炎症反应。内皮细胞（EC）表示模式识别受体，可以识别各种保守的细菌成分和危险分子，以及宿主的炎症介质如肿瘤坏死因子受体。这些受体的激活诱导内皮细胞分泌的细胞因子（ 例如 IL-6，IL-8，CXCL1和CCL2），并上调粘附分子（ 例如 E / P-选择素，VCAM-1和ICAM-1）在其细胞表面^{1 ，2。}所有这些分子促进本地化的感染和损伤部位的白细胞，中性粒细胞对感染的反应，以明确的传染性病原体的主机并发起组织修复^3,4涉及协调良好的血管内皮细胞和响应之间的相互作用中性粒细胞。 EC激活后，IL-8分泌，形成血管内梯度上的内皮细胞，使中性粒细胞感染或受伤的^5,6家中到现场。 E / P-选择素介导的中性粒细胞捕获和通过相对较弱协会与glycomolecules中性粒细胞表面滚动。这些相互作用，以及与IL-8其同源受体结合，促进强劲，中性粒细胞在内皮细胞表面^7-10整合素介导的附件，并最终逮捕。被逮捕后，嗜中性粒细胞可以迁移出具体感染部位，直接消除病原体，产生中性粒细胞胞外的陷阱，以防止病原体的传播，促进伤口愈合，并释放出额外的因素，招募其他的白细胞，如单核细胞，巨噬细胞和树突状血管细胞^11-17。

本报告中描述的是一种体外的方法来定量中性粒细胞的粘附，术后1血管性内皮细胞活化后由主机炎症介质TNFα。本试剂盒的目的是评估的激活的内皮细胞，而不是中性粒细胞。初级人类嗜中性粒细胞是首先使用密度梯度分离分离，然后标记的乙酰氧基甲基钙黄绿素（AM）。酯酶的活细胞内水解钙黄绿素AM的高荧光钙黄绿素分子的激发492-495 nm，发射513-516纳米^18。荧光标记的嗜中性粒细胞与EC的单分子膜，然后孵育，其后除去非粘附的中性粒细胞。剩余的，结合的嗜中性粒细胞的荧光，然后使用荧光分光光度计测定，计算作为一百分比的总的嗜中性粒细胞的荧光每孔输入。这种方法有绑定的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞用于分光额外的好处是可以用荧光显微镜直接观察，给予了更多的定性读出EC交流tivati​​on。由于此法是在静态条件下，只有非常初步的事件发生在中性粒细胞粘附级联评审会。这也证实在本报告中，使用E-选择素抗体阻断，表明中性粒细胞粘附的TNFα处理人肺微血管EC（HMVEC龙）单层与E-选择素的相互作用时，大大减少被打乱。

除了对TNFα，我们已经成功地使用这种检测人脐静脉EC（HUVEC）激活Toll样受体1/2激动剂肽相关脂蛋白（PAL），胞壁质脂蛋白（MLP）和Pam3Cys和程度来确定龙HMVEC激活由Pam3Cys ^19,20。此外，我们还成功地使用这种检测激酶抑制剂和RNAi介导的表面和胞质蛋白在HMVEC龙击倒后，表明这种方法是兼容与各种生化和screenin克分析^20。综上所述，这个实验提供了一个易于使用的，重现性好，功能更强大的方式来访问EC活化程度的炎症介质在体外 。