Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

תאי פיטום הם מאוד מגורענים מפעיל תאים חיסוניים המשמשים כמתווכים עיקריים באסטמה, אלרגיות, טפילים והגנת ^13-16 היווצרות הסרטן. הם מתגוררים כמעט בכל רקמת vascularized ^15, שבו הם בבטחה לאחסן מתווכים אלרגיים ודלקתיים בגרגרי cytoplasmic עד הופעלו לdegranulate. Degranulation הוא exocytosis של גרגרי קרום נכנסים, מה שגורם לשחרור של מתווכים פעילים פרמקולוגית כגון היסטמין, tryptase, ולאוקוטריאנים ^15. תוצאות תהליך זה בתחילתו של הסוג אני תגובות רגישות יתר שהם קריטיים בהגנה מפני טפילי הרכבה, כמו גם ייזום תגובות אלרגיות, אסתמה, ומסרטנות ^15.

תאי מאסט ובזופילים לבטא קולטנים FcεRI, הקולטנים גבוהה הזיקה לאימונוגלובולין E (IgE) ^17. חשיפה לאלרגן או אנטיגן גורמת לצבירה של קולטנים FcεRI IgE בכריכות מרובים ^17, וזה של זהO-נקרא "crosslinking" של קולטני Fc IgE בכריכות שיוזמת את תהליך degranulation: מפל של אירועי טירוזין זרחון, ההפעלה של פוספוליפאז C, זרימת הסידן מהחנויות פנימיות, וזרם של סידן לתוך התא ^18. זרימת סידן זה היא הכרחי עבור degranulation, ועוד יותר, מאותתת היתוך גרגיר עם הקרום לפני גרימת exocytosis גרגר ^15. בניסוי, ionophore סידן יכול לשמש לסיד מעבורת ישירות על פני קרום תא ^19, שלמעשה עוקף את כל התמרה אות שלבים לפני שלב זרימת סידן ^20, המאפשר את זיהוי של יעד על ידי מסלול toxicant כמו להיות במעלה הזרם או במורד הזרם של סידן איתות ^20.

Degranulation ניתן למדוד במהירות וביעילות על ידי ניטור שחרורו של β-hexosaminidase לsupernatant התא, אשר שוחרר לינארית מהגרגרים לצד היסטמין ^6, אבל אניזה הרבה יותר קל לזהות באמצעות תגובת אנזים-מצע וקורא microplate פשוט assay מוצר הניאון. assay microplate זה, כמפורט בסעיף הפרוטוקול, מבוסס על שיטה שפותחה במקור על ידי חזקה Naal et al. ^1, אשר מכמתת את המחשוף של מצע fluorogenic 4-methylumbelliferyl-N-אצטיל-β-D-β-glucosaminide ידי hexosaminidase. יש לנו שונה assay להשפעות של תרופות ובדיקת toxicants, עם triclosan מודגש כאן. שיטה זו אמינה מכמתת degranulation, הוא אלטרנטיבה זולה, למשל, שיטות זיהוי ²¹ המבוססים על תזרים cytometric, ויש לו הפוטנציאל להשאיל את עצמה יפה להקרנת תפוקה גבוהה של מגוון רחב של תרופות לטיפול באלרגיה, כמו גם immunotoxic או כימיקלים אלרגניים. הנקודה אחרונה זו חשובה במיוחד לאור בדיקת רעילות "2007 דו"ח המועצה הלאומי למחקר במאה ה ^-21: חזון וstrategy "(http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970), הפועל למען הפיתוח של בדיקות רעלים תפוקה גבוהה המנצלות תרבית תאים כדי להקטין את השימוש יקר של חיות מעבדה מסורתיות כגון עכברים. פרוטוקול degranulation שפותח על ידי Naal et al. ¹ והותאם על ידינו ^2, מנצל את שורת תאי RBL-2H3, שהוא מודל מקובל היטב הומולוגית לתאי פיטום ריריים אדם או בזופילים ^3-5. (שיטות לתאי RBL-2H3 culturing מפורטות באצ'ינסון ואח'. ^22). assay זה סביר יכול להיות מותאם לכל סוג תא תורן מצורף.

Triclosan (TCS) הוא מיקרוביאלית ספקטרום הרחב שהיה בשימוש כבר יותר מ -30 שנים בבתי חולים, מוצרי טיפוח, ומוצרים צריכה ^23,24. אופן פעולה אופייני למיקרוביאלית של TCS הוא העיכוב של סינתזת חומצות שומן, ככל הנראה על ידי עיכוב enoyl-acylרדוקטאז מנשא חלבון ^25,26. הוא נמצא בעולם במגוון רחב של מוצרים צריכה, כגון ג'ל רחצה, קרם ידי, משחת שיניים, מי פה, וסבונים ביד בריכוזים של עד 0.3% או 10 מ"מ ^24. שימוש נרחב של TCS הביא רמות לגילוי בבני אדם ^וב27-29 נהרות ונחלים ^30. מחקר שנעשה על ידי Allmyr et al. הוכיח כי ²⁷ TCS ומטבוליטים שלה נמצאים גם הפלזמה וחלב מאמהות מיניקות. חשוב לציין, TCS נספג בקלות אל תוך העור ^31-37. Queckenberg et al. ~ ³⁷ מצאו קליטת 10% מ~ 70 מ"מ TCS קרם לעור אנושי בתוך 12 שעות, וכתוצאה מכך הריכוז משמעותי בעור, שבו תאי פיטום מתגוררים.

TCS הוכח קליני כדי לנהל את מחלת עור אלרגית אנושית ^7-11, אבל המנגנון שבאמצעותו TCS מקל על מחלות עור אלרגיות כבר ידוע ^38. שימוש detaile assay microplate הניאוןד בסרטון הזה, אנחנו לאחרונה הוכיחו כי TCS, בריכוזים נמוכים כמו 2 מיקרומטר, פוגם באופן משמעותי את תפקוד תא תורן וdegranulation, מתן הסבר פוטנציאל לנתונים קליניים אלה ^2. בנוסף למתן הסבר לנתונים קליניים אלה, הממצאים שלנו בפאלמר et al. ² מציעים לי TCS מטרות מולקולות איתות במורד הזרם של זרימת סידן. , TCS עלול להיות בשל חשיבותו של הסידן באיתות חיסונית רבים ותהליכים ביולוגיים אחרים השפעות שליליות על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים הדרושים. למעשה, Udoji et al. הראו כי ³⁹ TCS מדכא פעילות תאי רוצח טבעית אנושית ממס, תפקוד מערכת החיסון מולדים חשוב נוסף.

מעבר לפוטנציאל שלה ככלי עזר טיפולי במחלת עור אלרגית (או, לחלופין, כimmunotoxicant), TCS יכול להיות גם האנדוקרינית משבש ^40-49. לפיכך, נוהל ברור על איך להכין כימיקל זה בפתרון אנישל עניין לtoxicologists. בגלל TCS הוא מולקולה הידרופובי קטנה, כלי רכב אורגניים משמשים לעתים קרובות כדי להפוך אותו ליותר מסיס במים. ברוב המחקרים רעילות שבו TCS כבר נבדקו, הכנה כרוכה בפירוק במים בעזרת ממס אורגני כגון אתנול, אצטון, או שמן ^2,50,51. עם זאת, לעתים קרובות פעמים ממסים אלה הן פעילים מבחינה ביולוגית את עצמם, ובכך סבכו את הפרשנות של הבדיקה כימי נתונים ^51. למעשה, על פי Rufli et al. ⁵² ואחרים ^53, מומלץ שפתרונות בדיקה לניסויים רעילות מים מוכנים באמצעות שיטות פיסיות על פני שיטות כימיות, בשל הפוטנציאל של ממסים כימיים כדי ליצור חפצים רעילות. יש לנו הראינו בעבר כי TCS מומס באתנול / מים (כרך / כרך) 0.24% וsonicated למשך 30 דקות dampens degranulation תא תורן RBL ^2. אתנול בריכוזים גבוהים יותר מאשר 0.24% הוכח לצנן degra תא תורןnulation ^{54,55-דוגמאות} להשפעות שעלולים להיות המבלבלות של ממסים אורגניים על מחקרים רעילות.

לא רק שזה חשוב להביא בחשבון את ההשפעה של ממסים על האורגניזם או תאים המשמשים למחקר, אבל גם זה חשוב לעקוב אחר ההשפעה של ממס בכימי המבחן עצמו. לדוגמה, Skaare et al. מצאו כי ⁵¹ המסת TCS בפוליאתילן גליקול (נפוץ במשחות שיניים ושטיפת פה) נחלשו השפעות אנטי בקטריאלי ואנטי פלאק בנשים נשיות בריאים בזמן פירוק בשמנים נגרם אובדן תפקוד מלא. לכן, היכולת של ממסים שונים כדי לווסת toxicant וסמים, כולל TCS, אפקטים יש לשקול בעיצוב assay. שימוש בשמנים או תוספי טעם עלול להפריע את ההשפעות של TCS במוצרים שונים ^50,51.

במאמץ למנוע את הצורך בשימוש בממסים אורגניים, שיפרנו על השיטה שלנו להמסת TCS ² על ידי ביטול השימוש בסול אורגנילפרוק. בפרוטוקול הנוכחי, אנו לפזר גרגרי TCS ישירות לתוך המאגר מימית עם חום (≤ 50 מעלות צלזיוס), ולאחר מכן לוודא את הריכוז של מניית TCS זה על ידי ספקטרופוטומטריה UV-Vis. שיפורים אלו אפשריים כי TCS הוא מסיס במים עד 40 מיקרומטר (http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf) והוכח להתנגד השפלה כאשר מחומם ל -50 מעלות צלזיוס (http:/ / Oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf) ^56,57. יש לנו גם יתרון נוסף של ספקטרופוטומטריה UV-Vis, כמו TCS ידוע גם לקלוט חום ב280 ננומטר ⁵⁸ עם מקדם הכחדה טוחנת של 4,200 ליטר / מול / ¹² ס"מ.

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה, אך יעילה לפזר גרגרי TCS למאגר ללא סיוע של ממס אורגני, ובכלל זה בעלות נמוכה ואימות מהירהריכוז, ומתאר assay microplate ניאון רב עוצמה למעקב אחר השפעות כימיות על degranulation תא תורן.