Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu
Summary
Doğuştan gelen bağışıklık tepkisi patojen enfeksiyonuna karşı koruma sağlar organizmalar. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin önemli bir bileşeni, fagosit solunum patlaması, istila eden mikroorganizmaları öldürmek reaktif oksijen türleri oluşturur. Biz, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi kimyasal uyarılmaktadır zaman üretilen reaktif oksijen türleri rakamlarla bir solunum patlaması tahlili tarif eder.
Abstract
Fagosit solunum patlaması patojen enfeksiyonuna karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir parçası olan ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini içerir. ROS zehirlidir ve fagosite mikroorganizmaları öldürmek için işlev görürler. Fagosit türevi ROS in vivo miktar güçlü bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi için bir organizmanın yeteneği ile ilgili bilgi sağlar. Burada fagosit solunum patlaması kimyasal indüksiyon üzerine tüm Zebra balığı embriyolarının ROS ölçmek ve karşılaştırmak için bir protokol açıklar. Bu yöntem, ROS tarafından oksidasyonu ve onu takiben floresan haline olmayan bir floresan bileşik kullanır. Bireysel embriyolar, zebra balığı, bir mikroplaka oyuklarına pipetle ve solunum patlaması bir kimyasal uyarıcı ile ya da olmadan, bu flüorojenik alt-tabaka içinde inkübe edilir. Her çukurdaki floresans bir mikro levha okuyucusu kullanarak arzu edilen zaman noktalarında ölçülür. Floresans okumaları floresan arka plan ortadan kaldırmak için ayarlandı ve daha sonra işbirliği vardıreşleştirilmemiş t-testi kullanılarak mpared. Bu yöntem, farklı gelişim aşamalarında ve bu protein demonte, aşırı ekspresyonuna veya farmakolojik maddeler ile tedavi olarak deneysel manipülasyonlar tepki olarak zebrafish embriyoların solunum patlama potansiyelinin karşılaştırma sağlar. Bu yöntem aynı zamanda yetişkin zebrafish böbrekler ve diğer bazı balık türleri ikinci bütün Dissected böbrek veya hücre preparasyonlarda solunum patlaması yanıtını izlemek için kullanılabilir. Biz bu protokolün göreceli basitlik ve uyum mevcut protokolleri tamamlayacak ve daha doğuştan gelen bağışıklık tepkisini anlamaya çalışırlar araştırmacıların ilgi olacağına inanıyoruz.
Introduction
Doğal ve adaptif bağışıklık: Bağışıklık sistemi iki koldan oluşur. Doğuştan bağışıklık evrimsel adaptif bağışıklık daha eskidir. Omurgalılar hem doğal ve adaptif şubeleri sahip iken Omurgasız anda, sadece doğuştan bağışıklığı olması düşünülmektedir. Adaptif bağışıklık belirli patojenlere karşı özel ve uzun süreli bağışıklık sağlamasına rağmen, doğuştan gelen bağışıklık istilacı bakteri, virüs ve mantarlar için hemen bir yanıttır. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtının bir önemli yönü yabancı istilacıları yutmak ve yok etmek fagositlerce (örneğin makrofajlar, nötrofiller) iltihabı ve işe sonuçlanan sitokin ve kemokin salınımını içerir.
Başarılı doğuştan gelen bağışıklık tepkileri içerir: mikroorganizmalara (1) tanıma, uygun sinyalizasyon kaskadlar (sitokinler ve kemokinlerin örn. ayırıcı) (2) indüksiyon; fagositik hücrelerin (3) düzgün gelişimi yeterli / numaraları; (4) Enfeksiyon bölgelerinde fagositlerin göç; patojenlerin (5) yutulma ve sardı mikroorganizmaların (6) imha. Bu adımlardan herhangi birinde bir eksiklik bunalan ana yol ve enfeksiyona yenik olabilir. Tüm bitki ve hayvanlarda patojenlere karşı ilk savunma hattı olduğu için sağlam bir doğal immün yanıt organizmaların sağlığı için çok önemlidir. Omurgalılarda, aynı zamanda adaptif bağışıklık tepkisini 1 güçlendirir. Bu nedenle, biz daha iyi anlamak ve onun işlevini optimize etmek için doğal immün yanıtın tüm yönleriyle değerlendirmek mümkün olduğu önemlidir.
Çoğu model organizma Arabadopsis dan C arasında değişen, doğuştan gelen bağışıklık incelemek için kullanılır kültürlenmiş insan hücrelerine farelerine Drosophila için elegans. Doğuştan gelen bağışıklık çalışma zebrafish (Br.rerio) model sistemi kullanmanın bir avantajı, zebra balığı, doğal ve adaptif hem im ile, bir omurgalı olmasıdırimzalamıstır, henüz doğal ve adaptif bağışıklığın gelişmesi geçici ayrılmış edilir. Adaptif bağışıklık tamamen işlevsel hale gelene kadar Zebra balığı yaklaşık 4-6 hafta sonrası döllenme 2 oluştuğu, sadece enfeksiyona karşı koruma için doğuştan bağışıklık güveniyor. Genetik manipülasyon, optik berraklık ve hızlı, dış gelişimi için araçlara ek olarak, zebra balığı embriyoların savunma prensibi modu olarak doğuştan gelen bağışıklık in vivo olarak doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin karmaşıklıklarını çalışma için hangi basitleştirilmiş bir model sağlar.
Çoklu protokolleri zebrafish embriyolarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin farklı yönleriyle değerlendirmek için geliştirilmiştir. Mikrodiziler ve RNAseq zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ile ortaya sitokin profilleri insanlarınkine benzeyen ve aynı zamanda doğal bağışıklık 3,4 beklenmedik genleri olduğunu ileri sürmüşlerdir onaylamıştır. Zebra balığı embriyo ve floresan, Transgen ve şeffaflıkpatojen ve zebrabalıkları ic suşları gerçek zamanlı in vivo dinamik konak-patojen etkileşimleri görselleştirme için izin verir. Nötrofil spesifik miyoloperoksidaz promoter 5,6 veya makrofaj özgü MPEG1 promoter 7 kontrolü altında GFP sentezleyen transgenik zebra balığı embriyolarının görselleştirmek ve ölçmek phagocyte göç lokalize enfeksiyonlar 8 siteleri yanı sıra fagositoz ve yıkımı ve görselleştirmek için mümkün kılmıştır floresan 8,9 patojenler etiketli. Zebrafish embriyoları, aynı zamanda, yüksek verimli deneyler ve kimyasal ekranlarının üretimi için uygundurlar. Bu duruma göre, enfeksiyon 10 ve kimyasal olarak neden olduğu hasarı 11 bölgelerine göç fagosit üzerine transcriptome analizi, yüksek verimli yöntemleri yakın zamanlarda geliştirilmiştir.
Yukarıda listelenen tekniklerin hiçbiri nicel fagositlerce patojen imha son aşamasını değerlendirmek. Bu son aşamayuttu patojenleri öldürmek bir solunum patlaması (yani ROS üretimi ve diğer toksik bileşikler) içerir. Enzimi NADPH oksidaz fagositik hücrelerde ROS önemli bir kaynağıdır. Oksijene elektron transferi NADPH oksidaz enzimi sonuç alt birimlerin montajı, süperoksit anyonlar üreten. Daha sonra enzimatik reaksiyon yoluyla, süperoksit sonra hidrojen peroksit ve hidroklorik asitten (Şekil 1A) dönüştürülebilir. Bu patojenler öldürür ve bu nedenle, zebra balığı embriyoların solunum patlaması potansiyelinin ölçümü genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık göstergesidir fagositlerin solunum patlaması olduğunu. Bireysel embriyolar zebrafish 12 gruplar halinde solunum patlamaları ve ölçmek için bir floresan bazlı bir deney geliştirilmiştir. Bu deney, bir ticari olarak temin edilebilir, hücre-geçirgen boyanın floresan olmayan, indirgenmiş formu kullanır. Bu boya, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (H2DCFDA), floresan dönüştürülüroksidasyon üzerine cent bileşik, 2 ', 7'-diklorofloresandiasetat (DCF),. Fagosit solunum patlaması tarafından üretilen çeşitli ROS H2DCFDA okside ve floresan 24 üretebilirsiniz. Floresans görünümü zebrabalıkları grupları arasında solunum patlaması yanıtı ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Protein kinaz C agonist forbol miristat asetat (PMA) kimyasal olarak ROS üretimi için NADPH oksidaz uyarılması ve bu nedenle floresan okumaları (Şekil 1 B) arttırmak için kullanılır. Burada, bu zebra balığı embriyo solunum patlaması deneyinin değiştirilmiş ve optimize edilmiş bir versiyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu deney, zaman ve / veya deneysel manipülasyonlar (örneğin, morfolino aracılığında protein yok etme) tepki olarak tek zebrafish embriyoların gruplar arasındaki solunum patlamaları ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntemin kullanılması, diğer zebra balığı doğuştan gelen bağışıklık deneyleri ile bağlantılı olarak, karmaşık ve kritik ilişkin daha eksiksiz bir görüntü sağlayacakDoğuştan gelen bağışıklık tepkisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fagositlerin birincil işlevi patojenleri tespit yutmak ve yok etmektir. Uygun bir solunum patlamaları üretmek için fagositoz yeteneği bu işlev için kritik öneme sahiptir. Böylece, solunum patlaması tepkisinin ölçümü kişi ve / veya deneysel manipülasyonlar tepki olarak grupları arasında genel olarak doğuştan gelen bağışıklık sağlık ve fonksiyon karşılaştırma yapmak için bir yöntemdir. Burada biz neden ölçmek ve tek tek zebra balığı embriyoların gruplar arasındaki solunum patlaması…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Kim laboratuvar, yararlı tartışmalar ve veri paylaşımı için Zebrafish bakım ve onarım, Dr Robert Wheeler Mark Nilan geçmiş ve şimdiki üyelerine de teşekkür ve NIH hibe 3RO1GM087308-02S1 ve 1P20RR024475-01A2 ve Maine Tarım ve Orman olur finansman için Station (Yayın Numarası 3303) Deney.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
