제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화
Summary
선천성 면역 반응은 병원체의 감염에 대한 유기체를 보호합니다. 타고난 면역 반응의 중요한 구성 요소, 식세포 호흡 버스트, 침입 미생물을 죽이는 활성 산소를 생성한다. 우리는 타고난 면역 반응이 화학적으로 유도 될 때 생성 된 활성 산소 종을 정량화 호흡 버스트 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
식세포 호흡기 버스트는 병원균 감염에 대한 선천성 면역 반응의 일부이며, 반응성 산소 종 (ROS)의 생성을 포함한다. ROS는 독성이 phagocytized 미생물을 죽이는 기능을한다. 식세포 유래 ROS의 생체 정량화 강력한 타고난 면역 반응을 탑재 할 수있는 유기체의 능력에 관한 정보를 제공합니다. 여기서 우리는 식세포 호흡 버스트의 화학 유도에 전체 제브라 피쉬 배아에 ROS의 양을 비교하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 활성 산소에 의한 산화에 따라 형광이되는 비 형광 화합물을 사용한다. 개인 제브라 피쉬 배아는 마이크로 플레이트의 웰에 피펫과 호흡 버스트의 화학 유도 유무에 관계없이이 형광 기판에서 배양된다. 각 웰의 형광 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 원하는 시점에서 정량화한다. 형광 판독이 배경 형광을 제거하도록 조절하고 공동 아르짝 t-검정을 사용하여 mpared. 이 방법은 서로 다른 발달 단계에와 단백질의 최저, 과발현 또는되는 약물과 치료로 실험 조작에 대한 응답에있는 제브라 피쉬 배아의 호흡 버스트 잠재력의 비교를 할 수 있습니다. 이 방법은 또한 어른 지브라 피쉬의 신장 및 다른 어류로부터 해부 전체 신장 또는 세포 제제의 호흡 버스트 응답을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 우리는이 프로토콜의 상대적 단순성과 적응성이 기존의 프로토콜을 보완하고 더 나은 타고난 면역 반응을 이해하고자 연구에 관심이있을 것이라고 믿는다.
Introduction
타고난 및 적응 면역 : 면역 시스템은 두 가지로 구성되어 있습니다. 선천성 면역은 진화 적으로 적응 면역보다 더 고대합니다. 척추 동물은 모두 타고난 및 적응 가지를 가지고 반면, 무척추 동물은 현재 만 선천성 면역을 것으로 생각됩니다. 적응 면역은 특정 병원체에 대한 구체적이고 오래 지속되는 면역을 부여하면서, 선천성 면역은 침입 한 세균, 바이러스, 곰팡이에 즉각적인 반응이다. 타고난 면역 반응의 중요한 측면은 외국 침략자를 침몰하고 파괴하는 식세포 (예를 들어, 대 식세포, 호중구)의 염증과 모집 결과 사이토 카인과 케모카인의 방출을, 포함한다.
성공적인 선천성 면역 반응은 포함 : 침입하는 미생물의 (1) 인식, 적절한 신호 폭포 (사이토 카인과 케모카인의 예를 들어 릴리스)의 것 (2) 유도, 식세포의 (3) 적절한 개발 / 적절한 번호, (4) 감염의 사이트에 식세포의 이동, 병원균 (5) 말림, 그리고 가득 채우고 미생물 (6) 파괴. 다음 단계 중 하나의 결핍에 의해 압도되는 호스트로 이어질하고, 감염에 굴복 할 수 있습니다. 이 모든 식물과 동물의 병원균에 대한 방어의 첫 번째 라인 때문에 강력한 선천성 면역 반응은 생명체의 건강에 매우 중요합니다. 척추 동물에서, 또한 적응 면역 반응 1 potentiates. 따라서, 우리는 더 잘 이해하고 그 기능을 최적화하기 위해 선천성 면역 반응의 모든 측면을 평가할 수있는 것이 중요하다.
대부분의 모델 생물은 Arabadopsis에서 C.에 이르기까지, 선천성 면역을 연구하는 데 사용됩니다 배양 된 인간 세포로 쥐에 초파리에 엘레. 선천성 면역을 연구하기 위해 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 모델 시스템을 사용하는 장점은 제브라 피쉬는 타고난 및 적응을 모두 메신저로, 척추 것입니다지역 사회, 그러나 타고난 및 적응 면역의 발전은 시간적으로 분리됩니다. 적응 면역이 완전하게 작동 될 때까지 제브라 피쉬는 약 4-6 주 포스트 수정이 발생하는 단독 감염에 대한 보호를 위해 선천성 면역에 의존하고 있습니다. 유전자 조작, 광학 선명도와 급속한, 외부 개발을위한 도구뿐만 아니라, 제브라 피쉬 배아 방어의 원칙 모드로 선천성 면역은 생체 내에서 타고난 면역 반응의 복잡성을 연구하는 단순화 된 모델을 제공합니다.
다중 프로토콜은 제브라 피쉬 배아 선천성 면역 반응의 다른 측면을 평가하기 위해 개발되어왔다. 마이크로 어레이 및 RNAseq는 제브라 피쉬의 타고난 면역 반응에 의해 유발 사이토 카인의 프로파일은 인간의 그것과 유사하며 또한 선천성 면역 3,4 예상치 못한 유전자의 참여를 제안했다고 확인했다. 제브라 피쉬 배아 및 형광, transgen의 투명도병원균 및 제브라 피쉬의 IC 균주는 실시간으로 생체 내에서 동적 호스트 병원체 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다. 호중구 별 폐장 내 myeloperoxidase 프로모터 5,6 또는 대식 세포의 특정 MPEG1 발기인 7의 제어하에 GFP를 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬 배아 시각화하고 정량화 식세포의 이동을 지역화 감염 8의 사이트뿐만 아니라 식균 작용과 파괴를 시각화하는 것이 가능하게했다 찬란 8,9는 병원균 표시. 제브라 피쉬 배아는 높은 처리량 분석 및 화학 화면의 생성에 순종합니다. 따라서, 감염 (10)과 화학적으로 유도 부상 11의 사이트에 식세포의 이동에 따라 사체 분석의 높은 처리량 방법은 최근에 개발되었다.
위에 나열된 기술, 아무도 정량적 식세포에 의해 병원균 파괴의 마지막 단계를 평가하지 않습니다. 이 마지막 단계침몰 병원균을 죽일 호흡 버스트 (즉, 활성 산소의 생산 및 기타 독성 화합물)을 포함한다. 효소 NADPH 산화 효소는 식세포에서 ROS의 주요 원천입니다. 산소에 대한 전자의 전달에 NADPH 옥시 다제 효소 결과의 서브 유닛의 조립, 수퍼 옥사이드 음이온을 발생시킨다. 후속 효소 반응을 통해, 과산화물은 과산화수소 및 차아 산 (도 1a)로 전환 될 수있다. 그것은 병원균을 죽이기 때문에, 제브라 피쉬 배아의 호흡 버스트 가능성의 정량화가 전체 선천성 면역 건강을 나타내는 식세포의 호흡 버스트입니다. 우리는 개인의 제브라 피쉬 배아 12 개에서 호흡 버스트를 정량화 할 수있는 형광 기반의 분석을 개발했다. 이 분석은 시판, 세포 투과성 염료의 비 형광, 환원 된 형태를 사용합니다. 이 염료, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein 디 아세테이트 (H2DCFDA가)로 변환된다 fluores산화시 센트 화합물, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF). 식세포 호흡 버스트에 의해 생성 된 다양한 ROS는 H2DCFDA을 산화 및 형광 (24)를 생성 할 수 있습니다. 형광의 외형 지브라 피쉬의 그룹 사이 호흡기 버스트 반응을 정량화하고 비교하는데 사용될 수있다. 단백질 키나제 C 효능 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)는 화학적으로 활성 산소를 생산하는 NADPH 산화 효소를 유도하고, 따라서 형광 판독 (그림 1B)를 증가하는 데 사용됩니다. 여기서, 우리는이 제브라 피쉬 배아 호흡 버스트 분석의 수정 및 최적화 된 버전에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 분석은 시간이 지남에 및 / 또는 실험 조작 (예를 들어, 모르 폴리 노 – 매개 단백질 최저)에 대한 응답으로 개별 제브라 피쉬 배아의 그룹 간의 호흡 버스트을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 사용은, 다른 제브라 선천성 면역 분석법과 함께, 복잡하고 중요한의 더욱 완전한 그림을 제공 할 것이다타고난 면역 반응.
Protocol
Representative Results
Discussion
식세포의 기본 기능은 병원균을 감지 침몰하고 파괴하는 것입니다. 적절한 호흡 버스트를 생성하는 식세포의 능력은이 기능을 위해 중요하다. 따라서, 호흡 버스트 응답의 정량화는 개인 및 / 또는 실험 조작에 대한 응답의 그룹 사이에 일반적으로 선천성 면역의 건강과 기능의 비교를 할 수 있도록 한 방법입니다. 여기서 우리는, 유도의 양, 개인 제브라 피쉬 배아의 그룹 간의 호흡 버스트 반응?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 김 실험실, 도움이 토론과 데이터 공유를위한 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수, 로버트 윌러에 대한 마크 NILAN의 과거와 현재 회원을 인정, 그리고 NIH 보조금 3RO1GM087308-02S1과 1P20RR024475-01A2와 메인 농업 및 산림 것 자금 역 (공개 번호 3303)를 실험.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
