基质辅助飞行的完整蛋白质（MALDI-TOF）质谱分析激光解吸/电离飞行时间大于100 kDa的

1。蛋白样品制备：缓冲交易所（可选） 5-25微升微摩尔浓度的蛋白（1〜20微米）的是必要的。缓冲交换可以采用离心超滤设备（ 如的Vivaspin，赛多利斯）或离心凝胶过滤柱（ 如微型生物分拆6层析柱，Bio-Rad公司）29,30进行。缓冲液交换步骤可重复2〜3倍。缓冲交换的详细描述过往呈29,30。例如，我们利用20mM的三（羟甲基）氨基甲烷（ 即三）pH为8的最终缓冲液中。 注意：该步骤可以在许多情况下可以省略。它应进行时的蛋白质样品中含有的分子或缓冲剂，可以强烈地与MS检测干涉[ 例如甘油; 4 – （2 -羟基乙基）-1 -哌嗪乙磺酸，HEPES]。它也是有用改善曲先进而精湛的谱。 2。矩阵中提高自己的纯度（可选）令再结晶倒10毫升40％乙醇（乙醇）进入一个耐热烧瓶中。 添加600毫克的矩阵。 使用水浴和一个电阻加热器，温基质溶液，并搅拌，直到该矩阵用玻璃棒或磁力搅拌器的完全溶解。 直到你有一个饱和溶液重复步骤2。 注意：使用过大体积的溶剂或溶解远低于溶液沸点的矩阵将导致结晶或无结晶的差的产率都没有。 让溶液慢慢冷却。你可以把它在室温下进行几个小时，然后在4℃下过夜。注意：如果结晶都没有形成，结晶可以通过使用玻璃搅拌棒刮擦烧杯（正好在溶液表面的下方）的内部进行诱导。 通过过滤收集矩阵晶体。 漂洗结晶，用冰冷的溶剂的最小量和滤液它们。 使结晶干燥。可以使用真空此步骤。 3。 MALDI不锈钢目标的清洁冲洗MALDI板用甲醇（甲醇），用清洁纸巾实验室应用（ 如的Kimwipe）特制轻轻擦拭。 冲洗目标与H 2 O和清洁纸巾擦拭。 插入MALDI板在600毫升的烧杯中，并用50％乙醇覆盖。 超声处理的对象中用于在超声浴中10分钟的EtOH溶液。 如果有剩余的上盘残留物，重复再次1-4步骤。 最后，用甲醇目标（或水，见下面的注释），倾斜于所有的液体被收集在一个清洁的组织方式。让靶干燥，在室温或使用氮气气流。 注意：类似的过程，先前描述的15。 注意：用于目标的最后漂洗溶剂（甲醇或水）确定一些目标特性。如果目标是用MeOH冲洗，样品涂在目标使用水时，远远不止。 4。 α-CHCA薄层液的制备及其沉积在MALDI靶溶解的α-CHCA，在丙酮中，以使饱和溶液。 通过手（没有任何吸管）蘸10微升末端（ 例如 GELoader提示，Eppendorf）中的α-CHCA饱和溶液：少量的溶液将在尖端流（由于毛细现象）。 触摸非常迅速（ 即 1秒）的MALDI靶用移液管尖和沉积在MALDI靶的α-CHCA丙酮溶液。这将构成基质的薄层，其中所述蛋白质样品将被存入。尝试生成一薄层斑点尽可能小。 注意：当使用SA为基体，我们准备利用SA的丙酮饱和溶液薄薄的一层。 5。 SA，α-CHCA，DHB和CHCA_DHB混合25：虎斑溶液的制备制备20毫克/毫升的SA溶液的ACN，0.1％TFA（70:30，体积/体积）。 制备在乙腈20毫克/毫升α-CHCA溶液和5％甲酸（70:30，体积/体积）命名为“α-CHCA溶液”]。 制备在乙腈20毫克/毫升DHB溶液和0.1％三氟乙酸（TFA）（70:30，体积/体积）命名为“DHB溶液”]。 混合“的α-CHCA解决方案”和“DHB解决方案”在1:1的比例（体积/体积），获得“CHCA_DHB解决方案”。 注意：一个可以混合“的α-CHCA解决方案”和“DHB解决方案”在不同的比例，与质量小于100 kDa的蛋白质进行分析时。对于EXA投影机的简易40:60α-CHCA和DHB（体积/体积）之间的比值得到一个更好的分辨率，但不敏感（见讨论）。 6。在MALDI靶沉积样品存款0.5微升先前准备的α-CHCA薄层上的蛋白质样品。紧接在此之后，加入0.5微升的基质溶液（ 即 SA溶液或α-CHCA溶液或「CHCA_DHB混合物“）的。这意味着在目标样品与基质混合。 注意：通常1的蛋白质样品与基质以1:1的比例混合。这个比率是用于MALDI谱的良好质量的关键。如果你想测试不同的样品浓度，可以使用ACN_formic酸溶液（如上所述），以稀释样品。 注意：如果你愿意，你可以混合样品和基质在试管中，然后存入混“sample_matrix解决方案化“的薄层上。 注意：我们建议您测试不同的样品浓度，因为稀释样品可让您减少 ​​污染物的干扰。稀释样品，你可以使用ACN_formic酸溶液（如上所述），以稀释样品。 7。校准物沉积存款0.5微升的校准标准（ 如 “蛋白质标准二”，布鲁克道尔顿，不来梅），再加入0.5μL基质溶液中。 注：装入旁边的蛋白质样品点进行MALDI板（见讨论）的校准。 8。电离光谱采集校准物和蛋白质样品一旦样品和校准物干燥，你可以观察在显微镜下“斑”。这个观察是可选的，可能主要感兴趣的新手。为了获得样品的光谱，插入第ê目标在MALDI-TOF仪器，并选择合适的仪器参数，这些参数为不同的每种类型的设备。为了充分利用相应的设定应该遵循制造商的建议。作为一般的考虑分析完整蛋白质时，应该使用该仪器的线性模式（而不是在反射模式，这是适当的肽分析）。通常情况下，我们利用我们的仪器在正离子模式。此外，一个关键的参数是“脉冲离子提取”，这提高了仪器的分辨率31。在简单术语中，“脉冲离子提取”可以被定义为样品离子的产生，当离子被引向检测器加速的时间之间的停顿。在分析完整蛋白质，应使用一个“脉冲离子提取”（ 例如 500纳秒）观察肽时，大于（ 例如 80纳秒）。 选择适当的m / z范围，获取光谱ØF中的校准和校准仪器。当您获得您的样品的光谱，使用适当的激光强度（见讨论）。