Summary

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

Published: October 18, 2013
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Summary

Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements.

Abstract

La technique de patch-clamp est aujourd'hui la méthode la plus bien établi pour enregistrer l'activité électrique des neurones individuels ou leurs compartiments sous-cellulaires. Néanmoins, la réalisation d'enregistrements stables, même à partir de cellules individuelles, reste une procédure fastidieuse d'une complexité considérable. Automatisation de nombreuses étapes en collaboration avec l'affichage de l'information efficace peut grandement aider les expérimentateurs à effectuer un plus grand nombre d'enregistrements avec une plus grande fiabilité et en moins de temps. Afin de réaliser des enregistrements à grande échelle, nous avons conclu l'approche la plus efficace est de ne pas automatiser entièrement le processus, mais de simplifier les étapes expérimentales et de réduire les risques d'erreur humaine tout en intégrant efficacement l'expérience de l'expérimentateur et visuel. Avec ces objectifs à l'esprit, nous avons développé un système assisté par ordinateur qui centralise tous les contrôles nécessaires pour une expérience de patch-clamp multi-électrode dans une seule interface, un commercManette sans fil ially disponible, tout en affichant expérience en matière d'information et d'orientation des indices sur l'écran de l'ordinateur. Nous décrivons ici les différentes composantes du système qui nous a permis de réduire le temps nécessaire pour atteindre la configuration d'enregistrement et d'accroître sensiblement les chances de succès d'enregistrement grand nombre de neurones simultanément.

Introduction

La capacité d'enregistrer et de stimuler plusieurs sites avec une précision micrométrique est extrêmement utile pour atteindre expérimentalement une meilleure compréhension des systèmes neuronaux. De nombreuses techniques ont été développées à cette fin, mais aucun de permettre la résolution des submillivolt obtenue par la technique du patch-clamp, essentielle pour l'étude de l'activité de sous-seuil et des potentiels post-synaptiques individuels. Ici, nous couvrir le développement d'un système de patch-clamp assistée par ordinateur de douze électrode destinée à la stimulation et l'enregistrement d'un grand nombre de cellules individuelles avec une précision suffisante pour l'étude de la connectivité neuronale simultanément. Bien que de nombreuses autres applications peuvent être conçus pour un tel système, il se prête particulièrement bien à l'étude de la connectivité synaptique étant donné que le nombre de connexions possibles à l'intérieur d'un groupe de neurones croît proportionnellement au carré du nombre de neurones en question. Par conséquent, alors qu'un système à trois électrodes permet de tester l'occurrence d'un maximum de six raccordements et d'enregistrement le plus souvent un seul, l'enregistrement douze neurones permet de tester l'apparition d'un maximum de 132 connexions et en observant fréquemment sur ​​une douzaine (Figure 1). L'observation de dizaines de connexions permet simultanément d'analyser l'organisation de petits réseaux et impliquer des propriétés statistiques de la structure du réseau qui ne peut être sondé sinon 1. En outre, la stimulation précise de nombreuses cellules permet également la quantification de recrutement de cellules post-synaptiques 2.

Protocol

Une. Préparation de l'équipement manipulateurs de commande à partir d'un ordinateur Connectez chaque boîte de contrôleur de micromanipulateur à un ordinateur via les ports série (RS-232). Mettre en œuvre les commandes pour le positionnement, l'interrogation et le réglage des paramètres doivent être envoyés via le port série. Problèmes de vitesse et de compatibilité matérielle donnée C / C + + est recommandé que le langage de programmation. </li…

Representative Results

Après les méthodes décrites ci-dessus nous avons réussi à effectuer un enregistrement à cellules entières jusqu'à douze neurones simultanément, doublant presque le plus grand nombre de neurones simultanément patch-serrée jusqu'à présent. Des exemples de réseaux de connexions synaptiques directes entre les neurones pyramidaux enregistrée dans la couche V du cortex somato-sensoriel chez le rat sont présentés dans la figure 6. La détermination de profi…

Discussion

Une question se pose immédiatement général concernant le taux de réussite de la procédure que nous avons décrit. Pour les taux de réussite élevés préparation est essentielle. Les pipettes doivent avoir des ouvertures de pointe qui sont adéquates pour les cellules des êtres enregistrées. Filtrer la solution intracellulaire pour éviter le colmatage des pipettes est également important. Extrêmement propre, pipettes fraîchement tirées sont une autre exigence. Une distribution binomiale est le modèle le pl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, et Sonia Garcia pour de précieux conseils sur l'amélioration de la procédure d'automatisation de patch-clamp. Nous remercions Rajnish Ranjan pour obtenir des conseils et de l'aide avec la mise en œuvre de logiciels utiles. Ce travail a été financé en partie par le projet de l'UE Synapse et en partie par la Human Frontiers Science Program.

Materials

Microscope Olympus BX51WI 40X Immersion Objective
Manipulators Luigs & Neumann SM-5 Serial protocol used
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B SDK used
Camera Till Photonics VS 55 BNC analog output
Framegrabber Data Translation DT3120 SDK used
Oscilloscopes Tektronix TDS 2014 Serial communication
Data acquisition InstruTECH ITC 1600
Data acquisition National Instruments PCI-6221 Library used (.dll)
Pressure valve SMC SMC070C-6BG-32
Pressure sensor Honeywell 24PCDFA6G
Membrane pump Schego Optimal

References

  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
  3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
  4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
  5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
  6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
  7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
  8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
  9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
  10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
  11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
  13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

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Cite This Article
Perin, R., Markram, H. A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System. J. Vis. Exp. (80), e50630, doi:10.3791/50630 (2013).

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