Summary

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

Published: October 18, 2013
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Summary

Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Aufnahmen bilden eine komplexe Aufgabe. Hier zeigen wir, wie durch die Automatisierung vieler Versuchsschritten ist es möglich, den Prozess zur qualitativen Verbesserung der Leistung und der Anzahl der Aufnahmen zu beschleunigen.

Abstract

Die Patch-Clamp-Technik ist heute die etablierten Verfahren zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einzelnen Neuronen, Zellen oder Zell Fächern. Dennoch Erreichen eines stabilen Aufnahmen, auch aus einzelnen Zellen, bleibt ein zeitaufwendiges Verfahren von beträchtlicher Komplexität. Automatisierung von vielen Schritten in Verbindung mit effizienter Informationsanzeige kann sehr helfen Experimentatoren bei der Durchführung einer größeren Anzahl von Aufnahmen mit größerer Zuverlässigkeit und in weniger Zeit. Um großflächige Aufnahmen zu erreichen schlossen wir der effizienteste Ansatz ist nicht vollständig zu automatisieren den Prozess, sondern um die experimentellen Schritte zu vereinfachen und reduzieren die Chancen auf menschliche Fehler während effizient Erfahrung des Experimentators und visuelles Feedback Einbeziehung. Mit diesen Zielen vor Augen haben wir ein computergestütztes System, das alle notwendigen Kontrollen für eine Multi-Elektroden-Patch-Clamp-Experiment in einer einzigen Schnittstelle, einem commerc zentralisiert entwickeltmathematisch verfügbaren Wireless-Gamepad, während der Anzeige Experiment bezogene Informationen und Führungssignale auf dem Computer-Bildschirm. Hier beschreiben wir die verschiedenen Komponenten des Systems, die uns die Zeit zum Erreichen der Aufnahmekonfiguration zu reduzieren und die Chancen für die erfolgreiche Aufnahme einer großen Anzahl von Nervenzellen gleichzeitig zu erhöhen erlaubt.

Introduction

Die Fähigkeit, mehrere Seiten mit Mikrometer-Präzision aufnehmen und zu stimulieren ist sehr nützlich für experimentell ein besseres Verständnis der neuronalen Systemen. Viele Techniken haben zu diesem Zweck entwickelt worden, aber die submillivolt Beschluss der Patch-Clamp-Technik, die für das Studium unterschwellige Aktivität und einzelnen postsynaptischen Potentiale erreicht keiner erlauben. Hier behandeln wir die Entwicklung eines Zwölf-Elektrode computergestützten Patch-Clamp-System bei gleichzeitiger Aufnahme und Förderung einer großen Anzahl von Einzelzellen mit ausreichender Genauigkeit für die Untersuchung der neuronalen Konnektivität gerichtet. Während viele andere Anwendungen für ein solches System konzipiert werden, eignet es sich besonders gut für die Untersuchung von synaptischer Verbindungen gegeben, dass die Anzahl der möglichen Verbindungen innerhalb einer Gruppe von Neuronen wächst proportional zu dem Quadrat der Anzahl von Neuronen in Frage. Während also ein System mit drei Elektroden ermöglicht die Prüfung derAuftreten von bis zu sechs Verbindungen und meist Aufnahme eines einzigen, Aufzeichnungs zwölf Neuronen ermöglicht das Testen des Auftretens von bis zu 132 Anschlüsse, und oft mehr als ein Dutzend beobachtet (Abbildung 1). Die Beobachtung von Dutzenden von Verbindungen gleichzeitig ist es möglich, die Organisation von kleinen Netzwerken zu analysieren und zu schließen statistische Eigenschaften der Netzwerkstruktur, die nicht anderweitig 1 untersucht werden können. Darüber hinaus ermöglicht eine präzise Stimulation von zahlreichen Zellen auch die Quantifizierung der Rekrutierung von postsynaptischen Zellen 2.

Protocol

1. Vorbereitung der Ausrüstung Steuer Manipulatoren von einem Computer Schließen Sie jedes Mikromanipulator Controller-Box an einen Computer über serielle Schnittstellen (RS-232). Implementieren Sie die Befehle für die Positionierung, Abfrage und die Einstellungen vornehmen, um über die serielle Schnittstelle gesendet werden. Angesichts Geschwindigkeit und Hardware-Kompatibilitätsprobleme C / C + + als Programmiersprache empfohlen. Standardisieren Sie das Be…

Representative Results

Nach den oben beschriebenen Verfahren ist es gelungen, gleichzeitig ausführen Ganzzell-Aufzeichnung von bis zu zwölf Neuronen nahezu verdoppelt die größte Anzahl von Neuronen gleichzeitig patch-geklemmt so weit. Beispiele für Netzwerke der direkten synaptischen Verbindungen zwischen den pyramidalen Neuronen in Schicht V im somatosensorischen Cortex von Ratten sind in Abbildung 6 gezeigt. Die Bestimmung der Verbindungswahrscheinlichkeit Profile als eine Funktion der Zwis…

Discussion

Eine unmittelbare Frage stellt sich in der Regel über die Erfolgsquote des Verfahrens, die wir beschrieben. Für hohe Erfolgsraten Vorbereitung ist unerlässlich. Pipetten müssen Spitzenöffnungen, die ausreichend für den aufgenommenen Zellen Wesen sind. Filtern des intrazellulären Lösung verstopfte Pipette zu vermeiden, ist ebenfalls wichtig. Extrem sauber, frisch gezapftes Pipetten sind eine weitere Voraussetzung. Eine Binomialverteilung ist das einfachste Modell, die verwendet werden können, um zu verstehen, wi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi und Sonia Garcia für wertvolle Erfahrungsberichte zu Verbesserungen für die Patch-Clamp-Verfahren Automatisierung danken. Wir danken Rajnish Ranjan für wertvolle Ratschläge und Unterstützung bei der Software-Implementierung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der EU-Synapse-Projekt und teilweise von der Human Frontiers Science Program gefördert.

Materials

Microscope Olympus BX51WI 40X Immersion Objective
Manipulators Luigs & Neumann SM-5 Serial protocol used
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B SDK used
Camera Till Photonics VS 55 BNC analog output
Framegrabber Data Translation DT3120 SDK used
Oscilloscopes Tektronix TDS 2014 Serial communication
Data acquisition InstruTECH ITC 1600
Data acquisition National Instruments PCI-6221 Library used (.dll)
Pressure valve SMC SMC070C-6BG-32
Pressure sensor Honeywell 24PCDFA6G
Membrane pump Schego Optimal

References

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Cite This Article
Perin, R., Markram, H. A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System. J. Vis. Exp. (80), e50630, doi:10.3791/50630 (2013).

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