Summary

A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador

Published: October 18, 2013
doi:

Summary

De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.

Abstract

La técnica de patch-clamp es hoy en día el método más bien establecido para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas individuales o sus compartimentos subcelulares. Sin embargo, el logro de grabaciones estables, incluso a partir de células individuales, sigue siendo un procedimiento que consume tiempo de considerable complejidad. Automatización de los muchos pasos en conjunto con la pantalla de información eficiente puede ayudar enormemente experimentadores en la realización de un mayor número de grabaciones con una mayor fiabilidad y en menos tiempo. Con el fin de lograr grabaciones a gran escala concluimos el enfoque más eficiente no es para automatizar completamente el proceso, pero para simplificar los pasos experimentales y reducir las posibilidades de error humano al tiempo que incorpora de manera eficiente la experiencia del experimentador y la retroalimentación visual. Con estos objetivos en mente, hemos desarrollado un sistema de ayuda de computadora que centraliza todos los controles necesarios para una multi-electrodo experimento de patch-clamp en una sola interfaz, un comercgamepad inalámbrico ially disponibles, al tiempo que muestra de experimentos relacionados con las señales de información y orientación en la pantalla de ordenador. Aquí se describen los diferentes componentes del sistema que nos permitió reducir el tiempo requerido para alcanzar la configuración de grabación y aumentar considerablemente las posibilidades de grabar con éxito un gran número de neuronas al mismo tiempo.

Introduction

La capacidad para grabar y estimular múltiples sitios con precisión micrómetro es extremadamente útil para lograr experimentalmente una mejor comprensión de los sistemas neuronales. Muchas técnicas se han desarrollado para este fin pero ninguno permitir la resolución submillivolt logra mediante la técnica de patch-clamp, esencial para el estudio de la actividad subumbral y potenciales postsinápticos individuales. Aquí se describe el desarrollo de un sistema de patch-clamp asistida por ordenador de doce electrodo destinado a registrar y la estimulación de un gran número de células individuales con la suficiente precisión para el estudio de la conectividad neuronal simultáneamente. Mientras que muchas otras aplicaciones pueden ser concebidos para un sistema de este tipo, se presta particularmente bien para el estudio de la conectividad sináptica dado que el número de conexiones posibles dentro de un grupo de neuronas crece proporcionalmente al cuadrado del número de neuronas en cuestión. Por lo tanto, mientras que un sistema con tres electrodos permite probar laocurrencia de hasta seis conexiones y más a menudo grabación de una sola, la grabación de doce neuronas permite probar la ocurrencia de hasta 132 conexiones y observando con frecuencia más de una docena (Figura 1). La observación de decenas de conexiones simultáneamente hace posible el análisis de la organización de las redes de pequeñas y deducir propiedades estadísticas de la estructura de red que no se puede probar lo contrario 1. Por otra parte, la estimulación precisa de numerosas células también permite la cuantificación del reclutamiento de las células postsinápticas 2.

Protocol

1. Equipo de preparación Manipuladores de control desde un ordenador Conecte cada caja del controlador micromanipulador a una computadora a través de puertos serie (RS-232). Implementar los comandos para el posicionamiento, consultar y ajustar la configuración para ser enviados a través del puerto serie. Problemas de velocidad y compatibilidad de hardware Dadas C / C + + se recomienda como el lenguaje de programación. Estandarizar el sistema de referencia de …

Representative Results

Siguiendo los métodos descritos anteriormente hemos tenido éxito en la realización de la grabación de células enteras de hasta doce neuronas simultáneamente, casi duplicando el mayor número de neuronas simultáneamente parche-sujetada hasta ahora. Ejemplos de redes de conexiones sinápticas directas entre neuronas piramidales registrada en la capa V de la corteza somatosensorial de las ratas se muestran en la Figura 6. La determinación de los perfiles de probabilidad…

Discussion

Una pregunta inmediata suele surgir en relación con la tasa de éxito del procedimiento que hemos descrito. Para altas tasas de éxito la preparación es esencial. Las pipetas deben tener aberturas de punta que sean adecuados a los seres células grabadas. Filtrado de la solución intracelular para evitar pipetas obstruidos también es importante. Pipetas extremadamente limpias, de barril son otro requisito. Una distribución binomial es el modelo más simple que se puede utilizar para entender cómo estos problemas af…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría dar las gracias a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, y Sonia García de valiosos consejos sobre mejoras para la automatización de proceso de patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para el asesoramiento y la asistencia en la implementación de software de valor. Este trabajo fue financiado en parte por el proyecto Sinapsis de la UE y en parte por el Programa Científico Fronteras Humanos.

Materials

Microscope Olympus BX51WI 40X Immersion Objective
Manipulators Luigs & Neumann SM-5 Serial protocol used
Amplifiers Axon Instruments MultiClamp 700B SDK used
Camera Till Photonics VS 55 BNC analog output
Framegrabber Data Translation DT3120 SDK used
Oscilloscopes Tektronix TDS 2014 Serial communication
Data acquisition InstruTECH ITC 1600
Data acquisition National Instruments PCI-6221 Library used (.dll)
Pressure valve SMC SMC070C-6BG-32
Pressure sensor Honeywell 24PCDFA6G
Membrane pump Schego Optimal

References

  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473 (2010).
  3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
  4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
  5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
  6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
  7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
  8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
  9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
  10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
  11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -. M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003 (2011).
  13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

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Cite This Article
Perin, R., Markram, H. A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System. J. Vis. Exp. (80), e50630, doi:10.3791/50630 (2013).

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