A multi-electrodo Sistema Patch-clamp asistida por ordenador
Summary
De múltiples electrodos patch-clamp grabaciones constituyen una tarea compleja. Aquí se muestra cómo, mediante la automatización de muchas de las medidas experimentales, es posible acelerar el proceso que conduce a una mejora cualitativa en el rendimiento y el número de grabaciones.
Abstract
La técnica de patch-clamp es hoy en día el método más bien establecido para el registro de la actividad eléctrica de las neuronas individuales o sus compartimentos subcelulares. Sin embargo, el logro de grabaciones estables, incluso a partir de células individuales, sigue siendo un procedimiento que consume tiempo de considerable complejidad. Automatización de los muchos pasos en conjunto con la pantalla de información eficiente puede ayudar enormemente experimentadores en la realización de un mayor número de grabaciones con una mayor fiabilidad y en menos tiempo. Con el fin de lograr grabaciones a gran escala concluimos el enfoque más eficiente no es para automatizar completamente el proceso, pero para simplificar los pasos experimentales y reducir las posibilidades de error humano al tiempo que incorpora de manera eficiente la experiencia del experimentador y la retroalimentación visual. Con estos objetivos en mente, hemos desarrollado un sistema de ayuda de computadora que centraliza todos los controles necesarios para una multi-electrodo experimento de patch-clamp en una sola interfaz, un comercgamepad inalámbrico ially disponibles, al tiempo que muestra de experimentos relacionados con las señales de información y orientación en la pantalla de ordenador. Aquí se describen los diferentes componentes del sistema que nos permitió reducir el tiempo requerido para alcanzar la configuración de grabación y aumentar considerablemente las posibilidades de grabar con éxito un gran número de neuronas al mismo tiempo.
Introduction
La capacidad para grabar y estimular múltiples sitios con precisión micrómetro es extremadamente útil para lograr experimentalmente una mejor comprensión de los sistemas neuronales. Muchas técnicas se han desarrollado para este fin pero ninguno permitir la resolución submillivolt logra mediante la técnica de patch-clamp, esencial para el estudio de la actividad subumbral y potenciales postsinápticos individuales. Aquí se describe el desarrollo de un sistema de patch-clamp asistida por ordenador de doce electrodo destinado a registrar y la estimulación de un gran número de células individuales con la suficiente precisión para el estudio de la conectividad neuronal simultáneamente. Mientras que muchas otras aplicaciones pueden ser concebidos para un sistema de este tipo, se presta particularmente bien para el estudio de la conectividad sináptica dado que el número de conexiones posibles dentro de un grupo de neuronas crece proporcionalmente al cuadrado del número de neuronas en cuestión. Por lo tanto, mientras que un sistema con tres electrodos permite probar laocurrencia de hasta seis conexiones y más a menudo grabación de una sola, la grabación de doce neuronas permite probar la ocurrencia de hasta 132 conexiones y observando con frecuencia más de una docena (Figura 1). La observación de decenas de conexiones simultáneamente hace posible el análisis de la organización de las redes de pequeñas y deducir propiedades estadísticas de la estructura de red que no se puede probar lo contrario 1. Por otra parte, la estimulación precisa de numerosas células también permite la cuantificación del reclutamiento de las células postsinápticas 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una pregunta inmediata suele surgir en relación con la tasa de éxito del procedimiento que hemos descrito. Para altas tasas de éxito la preparación es esencial. Las pipetas deben tener aberturas de punta que sean adecuados a los seres células grabadas. Filtrado de la solución intracelular para evitar pipetas obstruidos también es importante. Pipetas extremadamente limpias, de barril son otro requisito. Una distribución binomial es el modelo más simple que se puede utilizar para entender cómo estos problemas af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi, y Sonia García de valiosos consejos sobre mejoras para la automatización de proceso de patch-clamp. Agradecemos Rajnish Ranjan para el asesoramiento y la asistencia en la implementación de software de valor. Este trabajo fue financiado en parte por el proyecto Sinapsis de la UE y en parte por el Programa Científico Fronteras Humanos.
Materials
| Microscope | Olympus | BX51WI | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-5 | Serial protocol used |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | SDK used |
| Camera | Till Photonics | VS 55 | BNC analog output |
| Framegrabber | Data Translation | DT3120 | SDK used |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS 2014 | Serial communication |
| Data acquisition | InstruTECH | ITC 1600 | |
| Data acquisition | National Instruments | PCI-6221 | Library used (.dll) |
| Pressure valve | SMC | SMC070C-6BG-32 | |
| Pressure sensor | Honeywell | 24PCDFA6G | |
| Membrane pump | Schego | Optimal |
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