생성 및 마우스의 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영을 사용하여
Summary
Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
Abstract
적절한 동물 모델에서 생성 및 혈관 병변 분석은 환부 형성의 병인 및 신규 한 치료의 작용에 관한 중요한 정보를 생성, 심장 혈관 질환에 대한 연구의 기초이다. 아테롬 발생하기 쉬운 마우스, 병변 유도 수술 방법 및식이 변형의 사용은 극적 질환 개발과 새로운 치료의 잠재적 인 기여 메커니즘에 대한 이해를 향상되었다.
고전적으로, 병변 분석은 2 차원의 조직 학적 기법을 이용하여 생체 외 수행된다. 이 문서에서는 동맥 병변의 3 차원 정량 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)의 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 이 기술은 비파괴 같이, 표준 조직 학적 및 면역 조직 화학적 분석에 부속으로서 사용될 수있다.
신생 내막 병변은 마우스 대퇴 예술의 와이어를 삽입하거나 결찰에 의해 유도 된동맥 경화 병변 동안 ERY은의 apoE 결핍 쥐에 동맥 경화 다이어트의 관리에 의해 생성되었다.
병변은 보완적인 조직 학적 및 면역 조직 화학 분석 다음 autofluorescent 방출의 OPT 영상을 이용하여 조사 하였다. 기본 혈관 벽에서 명확하게 구별 병변 OPT. 병변 크기 병소 용적과 최대 단면적의 계산을 가능하게 된 면적을 이용하여 2 차원의 섹션에서 계산되었다. OPT를 사용하여 생성 된 데이터는 기술의 정확성과 분석의 전통적인 방법에 (오히려 다른 것보다) 보완 가능성을 확인, 조직학을 사용하여 얻은 측정 값과 일치했다.
이 작품은 동맥 경화와 신생 내막 병변을 영상화에 대한 선택의 가능성을 보여줍니다. 그것은 혈관 리모델링의 일상적인 3 차원 정량화를위한 신속하고 많이 필요한 생체 기술을 제공한다.
Introduction
동맥 병변의 형성은 심혈관 질환 (1)과 관련된 높은 이환율과 사망률의 핵심입니다. 병변 형성을 손상이 동맥하도록 자유롭게 염증 반응에 의한 것으로 추정된다. 재 협착 병변을 신속하게 (스텐트 시술 후, 예를 들어) 급성 기계적 손상을 다음 개발할 반면 동맥 경화성 병변은 동맥벽 만성 상처에 대한 응답으로 서서히 형성한다. 동맥 병변의 발달에 기여하는 메커니즘은 종종 중요한 유전자 조작 (1)과 조합하여, 적절한 동물 모델을 사용함으로써 상당히 밝혀져왔다.
이 생체 내 및 생체 외에서 검출이나 작은 동물의 병변 분석을 위해 개선 된 방법의 개발로 변화되지만 병변의 크기 및 조성의 분석은 고전적 (생체 외, 2 차원 조직학에 크게 의존하고있다 <SUP> 3). 동맥 병변의 조직 학적 분석은 노동 집약적이고 시간 소모적이며, 3 차원 구조의 제한된 정보를 제공한다. 예를 들면, 병변은 일반적으로 부담 병변의 단면적을 측정함으로써 평가된다 (무작위로 선택된 어느 부위에서 또는 최대 폐색 부위). 이는 전체 병변 부담의 불완전한 분석을 제공합니다. 3 차원 화상 화 기술은 이러한 문제에 대한 해결 방안을 제공하지만 놀랍게도 몇 적합한 접근법 설명되었다 항목 마운트. 이것은 자기 공명 영상 (MRI) 4 및 X 선 단층 촬영 (CT) 5 단일 광자 공 초점 현미경에 대해 너무 크지 만 너무 작은 마우스의 혈관 크기에 주로 기인 할 수있다. 생쥐의 동맥 경화 병변의 연구에 생체 자기 공명 영상의 응용 프로그램 및 마이크로 CT들은 비교적 큰 동맥에서, 제한된 해상도를 제공합니다 제안합니다. 이에 추가, 상대적으로 긴 획득 시간이 필요합니다처리량 제한 (주사 비용을 증가)를 4,6-.
(예 : 빛 간섭 단층 촬영 3,7 및 사진 음향 단층 촬영 (8)과 같은) 새로운 광학 이미징 양식의 개발은 쥐의 동맥 병변의 이미지를 개선하기위한 많은 가능성을 제공합니다. 비슷한 잠재력은 마우스 배아의 분석을 할 수 있도록 개발 된 광학 프로젝션 단층 촬영 (OPT)으로 표시됩니다. OPT는 직경 9 ~ 0.3-10 mm에 이르기까지 이미지를 표본으로 설계되었다. 전송 된 영상은 다색 가시광 반투명 시료의 투명도를 기록하고,이 해부학 적 구조의 식별을 위해 사용될 수있다. 내생의 특정 파장 (예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴) 및 샘플에서 외생 형광 여기에 다음과 같은 빛의 방출 영상 기록 방출. 다른 조직 성분 유형 및 autofluorescent 종의 밀도에 차이가 수 있으므로이 또한 (해부학 적 정보를 제공 할 수있다현재). 또한, 면역 또는 유전자 발현의 분포는 적절한 형광 프로브 (10)를 이용하여 결정될 수있다. 어느 촬상 모드 (전송 또는 방출)의 경우, 광은 회전 샘플 (0.9 ° 씩 통상의 이미지 (400))와 같은 반복 촬상을 허용하도록 전하 결합 소자에 집중된다. 이들은 (예 원뿔 알고리즘을 사용하여 여과 역 투영 () 또는 반복적 재구성 등) 표준 단층 재구성 방법에 의하여 대량의 계산을 위해 사용될 수있다.
이전 커크비 등. (11)에 설명 된대로이 동영상은, 동맥 경화 및 신생 내막 병변의 빠른 정량화하고 비용 효율적인 3 차원 분석을 선택 우리의 새로운 응용 프로그램을 보여줍니다. 기법은 일반적으로 사용되는 세 가지 모델 병변 크기를 정량화하기에 적합한 것으로 나타났다 : (I) 대퇴 동맥 와이어 손상; apolipoprotei에서 (ⅱ) 대퇴 동맥 결찰, 및 (iii)식이 – 유도 된 죽상 경화증N E 결핍 (의 apoE – / -) 마우스.
Protocol
Representative Results
Discussion
3 차원 분석은 교체 또는 정지 동맥 병변 형성의 연구의 대부분을 뒷받침하는 2 차원 조직 학적 기술에 추가하기위한 큰 잠재력을 가지고있다. 여기 OPT는 (아마도이 기술을 이용하여 성공적으로 분석 할 수있는 가장 작은 혈관을 나타내는 뮤린 대퇴부 동맥에) 작은 쥐의 동맥에 나타낸다. 또한, 그러나, 동맥 (병변) 중소 규모 인간 혈관을 포함하는 다른 종에서 사용하기에 적합하다; 우리 그룹이 성공적으로 토끼 대동맥의 병변을 분석하는 기술을 사용하고있다 (Bezuidenhout 등;. 미 출판). OPT 전통적인 조직학 분석 비해 빠르게 증가 구조 정보를 약속하고 조직 학적 및 면역 조직 화학적 기법을 사용하여 두 샘플의 후속 분석을 방지하지 않는 장점을 갖는다.
OPT를 사용하여 제조 된 화상은 환부 형성의 위치를 보여주는 해부학 상세히 준이들 지역에서 병변의 크기입니다. 이 연구에 사용 된 동맥 따라서 (아마 회전 부정 정렬, 불완전 청소, 반사 / 굴절 아가로 오스의 정점에 포커싱 문제로 인한) 유물에 의해 어느 정도 손상 기술과 이미지 품질에 대한 해상도의 한계에 아마 가까운 . 그럼에도 불구하고, 요구 사항 (즉, 용기 벽의 층)이 남아 있고, 따라서 뚜렷한 기술 각 층의 정량화에 매우 유용하다. 사실상, 이미지는 샘플에서의 선택된 부위에서 혈관의 플라크 – 함유 섹션 병변 내강 부피의 측정뿐만 아니라, 병변의 단면적과 루멘을 제공하기 위해 신속하고 재현 가능하게 정량화 될 수있다. 대형 (대동맥)과 중간 크기 (대퇴, 경동맥, 쇄골) 쥐의 동맥 – 그 일반적으로 마우스의 동맥 경화 및 neotintimal 병변 형성의 분석에 사용이 – 성공적이었다이 방법을 사용하여 분석 하였다. 사실 우리는 지금 동맥 경화와 신생 내막 병변의 크기에 약리학 적 개입과 유전자 조작의 효과를 입증하는 OPT를 사용했다. 혈관 내피 세포에서 엔도 텔린 B 수용체의 선택적 삭제하지 않았다 (15) 반면, 예를 들면, 엔도 텔린 수용체 차단이 신생 내막 병변 형성을 변경. 쉬운 마우스에서 동맥 경화증, 효소 유전자의 결실 11β-HSD1 16 galectin 3 17 죽상 경화성 병변의 크기를 줄이기 위해 도시 하였다.
병변 볼륨의 정량은 OPT의 명백한 혜택입니다. 그것은 일반적으로 조직 학적 방법으로 얻은 것보다 동맥 4 총 병변 부담의 더 많은 정보 표시를 제공합니다. 전체 병변을 분석하는 것은 선박의 개별 섹션이 분석을 위해 선택하는 경우 필연적으로 발생합니다 선택 편견과 오류를 줄일 수 있습니다. 종 병변 프로파일의 생산은 OPT의 또 다른 힘이다부상 13,16 다른 유형 (도 5)에 의해 유발 된 병변의 비교에 의해 강조. 예를 들어, 완전한 결찰 와이어 삽입 모두 femero – 오금 분기에 가까운 거의 총 폐색을 유도. 와이어 손상, 동맥 결찰에 의해 유도되는 병변 크기가 급격히 감소하고 사라지는 반면, 스캔 된 부분의 전체 길이를 따라 연장 그러나 제조 병변. 이 패턴은 혈관의 가이드 와이어의 삽입에 의한 손상의 큰 범위와 일치한다. 조직 학적 섹션을 사용하여 비슷한 결과를 생성하는 비용이, 시간과 노동 집약적.
OPT의 장점은 (우리가 일상적으로 하루에 20 척을 스캔 한)가 생산하는 이미지의 품질과 상대 속도와 단순성을 포함한다. 화질이 3 차원 화상을 생성하기위한 다른 방법으로, 우수 또는 적어도 필적 나타나는 생체, Y (예컨대 MRI와 같은 마이크로 CT)등의 OPT가 (우리의 연구 / 이미지 일반적으로 1-2sec이었다에 대한 통합 시간)과 저렴 짧은 검사 시간을 필요로한다. 시료 준비는 수일에 걸쳐 연장되지만 작은 노동 혈관 일괄 제조 될 수 있어야하고, 데이터가 하나의 세션에서 취득 할 수있다. 따라서, 스루풋이 높고 스캐너의 확장 사용을 요구하지 않는다. 중요한 것은, OPT의 비파괴 특성은 면역 검사에 대한 관심의 위치를 식별하기 위해 사용될 수있는 수단; 따라서 절단의 양을 감소하고 필요한의 염색. 이것은 고해상도 초음파의 개발이 동맥 병변이 크기의 체적 정량 대체 방법을 제공하는 것을 가능하지만, 저자들은이 애플리케이션을 보여 모든 출판물 모르고.
아마도 당연히, OPT의 화질은 (물론, 단지 작은 샘플들에 수행 될 수있다) 현미경 기법에 떨어진다. 제안 된 상세 검색은 reconstructio하기데이터의 N 화질 19,20 향후 개선시킴으로써 이러한 한계를 해결할 수있다. 다른 방법론적인 관심사는 조직 처리 샘플의 특성을 변경하는 점이다. 예를 들어, 클리어링 제의 친 유성 성질은, 벤질 알코올 / 벤질 벤조 에이트 (BABB)는 물론, 탈수 및 지방 제거 단계도의 특징이며, 비록 종래 탈수 (수축을 일으킬 수 반면, 죽상 경화 병변에서 지질을 제거 가능성 파라핀 왁스에 포함 샘플 준비). BABB (예 : 글리세롤 21)은 형태 만 작은 변화가 발생 친수성 청소 에이전트와의 비교 등이 조사에 사용되었다.
특히 중요한 세포의 3 차원 배열을 추적하고 동맥 리모델링에 관련된 인자 시그널링에 관한 OPT의 발전 및 개선을위한 여러 가지 가능성이 존재한다. 이러한 인 동맥 조직 강한 형광도,해부학적인 이미지가 생성 N 장점은, 표백 (22)의 기존의 방법에 의해 급냉되지 않는 RNA 및 단백질 분포 패턴을 평가하기 위해 형광 프로브의 사용을 제한 할 수있다. 송신 촬상하여 시각화 비색 프로브의 사용은 (예를 들면 β 갈 락토시다 제)이 한계를 극복 할 수있다.
결론적으로, OPT는 쥐의 동맥의 내막에 병변의 3 차원 이미징을위한 큰 잠재력을 가지고있다. 그것은 일반적으로 노동 집약적이고 효율적으로 총 병변 볼륨을 나타내지 않는 2 차원 방법에 상당한 진보를 나타냅니다. OPT는 상대적으로 빠르고, 편리하고 비파괴입니다. 이미지 분석의 새로운 발전은 더 기술의 전력 및 유틸리티를 높일 것을 약속드립니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
(; 헨리 Dryerre 방식 LL)과 자금 조달 영국 심장 재단 (PWFH, BRW, DJW,이 작품은 에든버러 대학 (NSK)과 카네기 신뢰에서 studentships에 의해 지원되었다 RG를 / 05 / 008, PG / 05 / 007; PG / 08 / 068 / 25,461)와 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). 저자는 심혈관 과학 센터에 연구 우수상의 BHF-지원 센터에서 제공하는 자신의 일을 지원하기 위해 감사하고 있습니다.
저자는 신생 내막 병변 생산의 수술 모델의 설립에 교수 마사 타카 사타 (도쿠시마 대학) 및 (의학의 마운트 시나이 학교에서 박사 Ernane리스 '그룹) 박사 이고르 Chersehnev의 조언에 특히 감사하고 있습니다. 비디오 제작 및 SATA 등으로 사용할. (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) 특히 유용했다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
| Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| 15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
| 11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
| 11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
| 13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
| 18050-35 | Bulldog clips | ||
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
| Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
References
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