Summary

Mise en place d'un<em> In vitro</em> Système d'étudier le comportement intracellulaire de<em> Candida glabrata</em> En droits macrophages THP-1

Published: December 10, 2013
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Summary

Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l'interaction d'un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons.

Abstract

Un système modèle de culture cellulaire, si un synoptique proche des conditions d'environnement de l'hôte, peut servir comme une alternative peu coûteuse, facilement manipulable et reproductible pour des systèmes de modèles animaux pour l'étude d'une étape spécifique de l'infection par le pathogène microbien. Une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 qui, lors du traitement de l'ester de phorbol, se différencie en macrophages, a déjà été utilisé pour étudier les stratégies de virulence de nombreux pathogènes intracellulaires, y compris Mycobacterium tuberculosis. Ici, nous discutons d'un protocole d'adopter un modèle in vitro de culture cellulaire dans système à l'aide de macrophages THP-1 pour délimiter l'interaction d'un agent pathogène opportuniste humain de la levure Candida glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte. Ce système de modèle est simple, rapide, prête à écrans mutantes à haut débit, et ne nécessite pas de matériel sophistiqué. Un THP-1 expérience d'infection des macrophages typique prend environ 24 heures avec un 24-48 heures supplémentaires pour permettre intracellulaire récupérélevure de se développer sur un milieu riche pour colony forming analyse de la viabilité à base de parts. Comme d'autres systèmes modèles in vitro dans une éventuelle limitation de cette approche est la difficulté d'extrapoler les résultats obtenus à un circuit de cellule immunitaire très complexe existant dans l'hôte humain. Cependant, malgré cela, le protocole actuel est très utile pour élucider les stratégies d'un agent pathogène fongique peut employer pour échapper / contrecarrer réponse antimicrobienne et survivre, s'adapter, et de proliférer dans l'environnement pauvre en nutriments des cellules immunitaires de l'hôte.

Introduction

Espèces de Candida sont la principale cause des infections fongiques invasives potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés 1. Candida glabrata, un pathogène nosocomial émergents, est la deuxième ou troisième plus fréquemment isolés espèces de Candida chez des patients de l'unité de soins intensifs en fonction de la situation géographique 1-3. Phylogénétiquement, C. glabrata, une levure bourgeonnante haploïde, est plus étroitement liée aux Saccharomyces non pathogène modèle cerevisiae que de pathogène Candida spp., y compris C. albicans 4. Conformément à cela, C. glabrata manque quelques traits de virulence fongiques clés, y compris l'accouplement, l'activité protéolytique sécrétée et la plasticité morphologique 4-5.

Bien que C. glabrata ne fait pas hyphes, il peut survivre et se répliquer dans les macrophages murins et humains 6-8 suggérant qu'il a développé des mécanismes de pathogenèse uniques. Peu d'informations sont disponibles sur les stratégies que C. glabrata emploie pour survivre environnement macrophages intracellulaire pauvres en éléments nutritifs et de contrer oxydation et réponses de l'hôte non oxydants montés par les cellules immunitaires de l'hôte 5. Un système de modèle de macrophage pertinente est une condition préalable pour délimiter l'interaction de C. glabrata avec des cellules phagocytaires de l'hôte par des approches génomiques et protéomiques fonctionnels. Les cellules mononucléées du sang (PBMC) et des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) d'origine humaine et murine, respectivement, ont précédemment été utilisées pour étudier l'interaction de C. glabrata avec des cellules immunitaires de l'hôte 7,9. Cependant, la difficulté à obtenir les CMSP et BMDMs, leur durée de vie limitée et variation intrinsèque entre les différents bailleurs de fonds de mammifères limitent l'utilisation de ces cellules des systèmes modèles comme polyvalents.

Ici, nous décrivons une méthode pour l'établissement d'un système in vitro pour étudier la intracellulcomportement ar de C. glabrata cellules dans les macrophages issus de la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1. L'objectif global de ce protocole était d'adopter un système de modèle de culture cellulaire simple, peu coûteux, rapide et reproductible qui peut être facilement manipulé pour étudier différents aspects du pathogène interaction hôte-fongique.

Cellules THP-1 ont déjà été utilisées pour déchiffrer la réponse immunitaire de l'hôte contre une large gamme d'agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des champignons 10-12. Cellules monocytaires THP-1 sont faciles à entretenir et peuvent être différenciées, par traitement de l'ester de phorbol, de macrophages qui imitent les macrophages dérivés de monocytes humains et des macrophages expriment des marqueurs appropriés 13. Les principaux avantages de THP-1 système de modèle de macrophage sont la facilité d'usage et l'absence d'exigence d'un équipement sophistiqué.

Le protocole présenté ici est facilement adaptable pour étudier l'interaction d'autres agents pathogènes fongiques humains avec host cellules immunitaires. La procédure de courant peut également être utilisée pour identifier des facteurs de virulence de l'agent pathogène d'intérêt en utilisant des écrans de mutants à haut débit. Cette preuve de concept a été illustré par l'utilisation réussie de THP-1 système de modèle de culture pour identifier un ensemble de 56 gènes qui sont nécessaires pour la survie de C. glabrata dans les macrophages humains 8.

Protocol

Il est recommandé d'effectuer C. glabrata expériences d'infection dans un laboratoire avec un niveau de biosécurité de confinement 2 (BSL-2). Préparation des cellules THP-1 macrophage monocouche. C. Préparation d' glabrata suspension cellulaire. L'infection des macrophages THP-1 avec C. cellules glabrata. Mesure du taux de phagocytose et de la réplication intracellulaire par l'intermédiaire de formation de…

Representative Results

Analyse infection de PMA-traités macrophages THP-1 avec C. les cellules de type sauvage glabrata (wt) ont révélé que les cellules wt ont été phagocytés par des macrophages à un taux de 55-65% au bout de 2 h co-incubation. En outre, C. glabrata cellules étaient capables de résister à mort par les macrophages THP-1 et ont subi une moyenne de 5 – à 7 fois plus dans UFC après 24 heures de co-culture avec des macrophages THP-1 8. La réplication intracellulaire de c…

Discussion

Système immunitaire inné joue un rôle important dans le contrôle des infections fongiques opportunistes. Macrophages contribuent à la défense antifongique par ingestion et la destruction de l'agent pathogène fongique. Ainsi, l'élucidation des facteurs qui sont nécessaires pour la survie et / ou contrecarrer les fonctions antimicrobiennes des macrophages fera progresser notre compréhension des stratégies de virulence des champignons. Dans ce contexte, nous avons établi un système modèle in vitro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par Innovative jeune biologiste Prix BT/BI/12/040/2005 et BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subvention du Département de biotechnologie, gouvernement de l'Inde et les ressources de base de Centre pour empreintes génétiques et diagnostics, Hyderabad. MRN et GB sont les bénéficiaires de bourses de recherche junior et senior du Conseil de recherche scientifique et industrielle vers la poursuite d'un diplôme de l'Université de Manipal de doctorat. SB est le récipiendaire du Junior et Senior Research Fellowship du Département de biotechnologie vers la poursuite d'un diplôme de l'Université de Manipal de doctorat.

Materials

THP-1 American Type Culture Collection TIB 202 Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640 Hyclone SH30096.01 For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P 8139 Caution: Hazardous
YPD  BD-Difco 242710 For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS) Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)  Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium Vector Labs H-1200 For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP JONAKI-BARC LCP-102 For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes Corning 430167 To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate Corning 3527 To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide BD Falcon REF354104 To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer Rohem India For enumeration of cells
Table top microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 18 For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge Remi R-8C For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer Amersham Biosciences Ultraspec 10 To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator Labtech Refrigerated To grow C. glabrata cells
Shaker incubator New Brunswick Innova 43 To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator Thermo Electron Corporation Forma series 2 To culture THP-1 cells
Confocal microscope Carl Ziess Ziess LSM 510 meta  To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope Olympus CKX 41 To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine BioRad  DNA Engine To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven Labnet Problot 12S For hybridization 
PhosphorImager Fujifilm FLA-9000 For scanning hybridized membranes
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit Alphainnontech Alphaimager To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels

References

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Cite This Article
Rai, M. N., Borah, S., Bairwa, G., Balusu, S., Gorityala, N., Kaur, R. Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages. J. Vis. Exp. (82), e50625, doi:10.3791/50625 (2013).

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