Summary

Establecimiento de un<em> In vitro</em> Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em> Candida glabrata</em> En humanos THP-1 macrófagos

Published: December 10, 2013
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Summary

El presente artículo describe un protocolo para establecer un sistema modelo de cultivo celular in vitro para estudiar la interacción de un hongo patógeno intracelular facultativo humano Candida glabrata con macrófagos humanos que será una herramienta útil para avanzar en el conocimiento de los mecanismos de virulencia de hongos.

Abstract

Un sistema de modelo de cultivo celular, si un cierre sinóptico de las condiciones ambientales de acogida, puede servir como una alternativa económica, reproducible y fácilmente manipulable para sistemas de modelos animales para el estudio de un paso específico de la infección por patógenos microbianos. Una línea celular de monocitos humanos THP-1 que, tras el tratamiento del éster de forbol, se diferencia en macrófagos, que anteriormente se ha utilizado para estudiar las estrategias de virulencia de muchos patógenos intracelulares, incluyendo Mycobacterium tuberculosis. Caso, hablamos de un protocolo para promulgar un modelo in vitro de cultivo celular en sistema utilizando macrófagos THP-1 para delinear la interacción de un patógeno oportunista humano levadura Candida glabrata con células fagocíticas anfitrión. Este modelo de sistema es simple, rápido, susceptible de mutante pantallas de alto rendimiento, y no requiere de equipo sofisticado. Un típico THP-1 macrófagos infección experimento tarda aproximadamente 24 horas con un 24 a 48 horas más para permitir intracelular recuperadolevadura para crecer en medio rico para formación de colonias análisis de viabilidad basado en unidades. Al igual que otros sistemas de modelos in vitro en, una posible limitación de este enfoque es la dificultad en la extrapolación de los resultados obtenidos a un complejo altamente circuitos de célula inmune existente en el huésped humano. Sin embargo, a pesar de esto, el protocolo actual es muy útil para dilucidar las estrategias que un hongo patógeno puede emplear para evadir / anula la respuesta a los antimicrobianos y sobrevivir, adaptarse y proliferar en el ambiente pobre en nutrientes de las células inmunitarias del huésped.

Introduction

Las especies de Candida son la causa principal de las infecciones fúngicas invasivas potencialmente mortales en pacientes inmunodeprimidos 1. Candida glabrata, un patógeno nosocomial emergente, es la segunda o tercera especie más frecuentemente aislada de Candida procedentes de pacientes de la Unidad de Cuidado Intensivo, dependiendo de la ubicación geográfica 1-3. Filogenéticamente, C. glabrata, una incipiente levadura haploides, está más estrechamente relacionado con los Saccharomyces no modelo de la levadura patógena cerevisiae que al patógeno Candida spp. incluyendo C. albicans 4. Consistente con esto, C. glabrata carece de algunos rasgos de virulencia fúngicas clave, incluyendo el apareamiento, la actividad proteolítica secretada y plasticidad morfológica 4-5.

Aunque C. glabrata no forma hifas, puede sobrevivir y replicarse en macrófagos murinos y humanos 6-8 lo que sugiere que se ha desarrollado mecanismos de la patogénesis únicas. Hay poca información acerca de las estrategias que C. glabrata emplea para sobrevivir intracelular entorno macrófagos pobre en nutrientes y contrarrestar oxidativo y respuestas de acogida no oxidativos montados por las células inmunes del huésped 5. Un modelo de sistema de macrófagos pertinente es un requisito previo para delimitar la interacción de C. glabrata con células fagocíticas de acogida a través de enfoques de genómica y proteómica funcionales. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) de origen humano y murino, respectivamente, han sido utilizados anteriormente para estudiar la interacción de C. glabrata con las células inmunitarias del huésped 7,9. Sin embargo, la dificultad en la obtención de PBMC y BMDMs, su tiempo de vida limitado y la variación intrínseca entre las diferentes donantes de mamíferos restringen la utilización de estas células como sistemas de modelos versátiles.

Aquí se describe un método para la creación de un sistema in vitro para estudiar el intracellulcomportamiento ar de C. células glabrata en los macrófagos derivados de monocitos humanos línea celular THP-1. El objetivo general de este protocolo fue promulgar un sistema modelo de cultivo celular simple, barata, rápida y reproducible que puede ser fácilmente manipulado para estudiar diferentes aspectos de la interacción patógeno-huésped fúngica.

Las células THP-1 se han utilizado previamente para descifrar la respuesta inmune del huésped contra una amplia gama de patógenos, incluyendo bacterias, virus, y hongos 10-12. Células monocitos THP-1 son fáciles de mantener y pueden ser diferenciados, tratamiento previo de éster de forbol, a los macrófagos que imitan los macrófagos derivados de los monocitos de humano y expresan marcadores de macrófagos apropiados 13. Las principales ventajas de la THP-1 sistema de modelo de macrófagos son la facilidad de uso y la falta de equipo sofisticado requisito.

El protocolo que se presenta aquí es fácilmente adaptable para estudiar la interacción de otros hongos patógenos humanos con hoscélulas T inmunes. El procedimiento actual también se puede emplear para identificar los factores de virulencia para el patógeno de interés utilizando pantallas de mutantes de alto rendimiento. Esta prueba de concepto fue ejemplificado por el uso exitoso de THP-1 sistema de modelo de cultivo para identificar un conjunto de 56 genes que son necesarios para la supervivencia de C. glabrata en los macrófagos humanos 8.

Protocol

Se recomienda llevar a cabo C. glabrata infección experimentos en un laboratorio con nivel de contención de bioseguridad 2 (BSL-2). Preparación de células THP-1 macrófagos monocapa. Preparación de C. suspensión de células glabrata. La infección de las células THP-1 macrófagos con C. células glabrata. Medición de la tasa de fagocitosis y la replicación intracelular a través de la formación de colonias de ensayo unidad….

Representative Results

Analiza Infección del PMA tratados THP-1 macrófagos con C. células de tipo salvaje glabrata (en peso) revelaron que las células wt fueron fagocitados por los macrófagos a una velocidad de 55-65% después de 2 horas coincubación. Además, C. células glabrata podían resistir a la destrucción por macrófagos THP-1 y se les realizó un moderado 5 – al aumento de 7 veces en el UFC después de 24 h de cocultivo con macrófagos THP-1 8. La replicación intracelul…

Discussion

Sistema inmune innato desempeña un papel importante en el control de las infecciones fúngicas oportunistas. Los macrófagos contribuyen a antifúngica defensa por ingestión y destrucción del hongo patógeno. Por lo tanto, la elucidación de los factores que se requieren para la supervivencia y / o contrarrestar las funciones antimicrobianas de macrófagos avanzará nuestra comprensión de las estrategias de virulencia de hongos. En este contexto, hemos establecido un sistema in vitro modelo de cultivo celul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el innovador Biotechnologist Premio Joven BT/BI/12/040/2005 y concesión BT/PR13289/BRB/10/745/2009 del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India y los fondos centrales del Centro de impronta genética y Diagnóstico, Hyderabad. MNR y GB son los destinatarios de tercer y cuarto año de becas de investigación del Consejo de Investigación Científica e Industrial hacia la búsqueda de un título de doctorado de la Universidad Manipal. SB es el destinatario de Junior y Senior Research Fellowship del Departamento de Biotecnología hacia la búsqueda de un título de doctorado de la Universidad Manipal.

Materials

THP-1 American Type Culture Collection TIB 202 Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640 Hyclone SH30096.01 For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P 8139 Caution: Hazardous
YPD  BD-Difco 242710 For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS) Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)  Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium Vector Labs H-1200 For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP JONAKI-BARC LCP-102 For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes Corning 430167 To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate Corning 3527 To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide BD Falcon REF354104 To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer Rohem India For enumeration of cells
Table top microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 18 For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge Remi R-8C For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer Amersham Biosciences Ultraspec 10 To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator Labtech Refrigerated To grow C. glabrata cells
Shaker incubator New Brunswick Innova 43 To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator Thermo Electron Corporation Forma series 2 To culture THP-1 cells
Confocal microscope Carl Ziess Ziess LSM 510 meta  To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope Olympus CKX 41 To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine BioRad  DNA Engine To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven Labnet Problot 12S For hybridization 
PhosphorImager Fujifilm FLA-9000 For scanning hybridized membranes
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit Alphainnontech Alphaimager To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels

References

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Cite This Article
Rai, M. N., Borah, S., Bairwa, G., Balusu, S., Gorityala, N., Kaur, R. Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages. J. Vis. Exp. (82), e50625, doi:10.3791/50625 (2013).

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