설립<em> 체외</em> 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em> 칸디다 글라 브라</em> 인간 THP-1 식세포에
Summary
현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
세포 배양 모델 계, 호스트 환경 조건 부근 미믹, 미생물 병원체 감염의 특정 단계의 연구를위한 동물 모델 시스템을 저렴하고 재현성 쉽게 처리 가능한 대안이 될 수있는 경우. , 포르 볼 에스테르 치료시, 대 식세포로 분화된다 THP-1 인간 단핵구 세포주는 이전에 결핵균을 포함한 많은 세포 내 병원체의 독성 전략을 연구하기 위해 사용되었다. 여기서, 우리는 시험 관내 세포 배양 모델을 규정하는 프로토콜 토론 호스트 식세포 세포와 기회 주의적 인간의 효모 병원체 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 묘사하는 THP-1 대식 세포를 사용하여 시스템. 이 모델 시스템은 간단하고, 빠르고, 높은 처리량 돌연변이 화면에 순종하고, 더 정교한 장비가 필요하지 않습니다. 전형적인 THP-1 대식 세포 감염 실험 복구 세포를 허용하는 추가 ~ 48 시간으로 약 24 시간 소요식민지 단위 기반의 생존 분석을 형성하기 위해 다양한 매체에 성장 효모. 다른 시험 관내 모델 시스템과 같이,이 접근법의 가능한 제한은 인간 숙주에 존재하는 매우 복잡한 면역 세포 회로에 얻어진 결과를 외삽 곤란하다. 그러나 이것에도 불구하고, 현재의 프로토콜은 곰팡이 병원균 / 회피 항균 응답을 방해 생존, 적응 및 숙주 면역 세포의 영양이 부족한 환경에서 증식하는 데 사용할 수있다 전략을 명료하게하는 것은 매우 유용합니다.
Introduction
칸디다 종은 면역 저하 환자의 1에 생명을 위협하는 침습성 진균 감염의 주요 원인이다. 칸디다 글라 브라, 신흥 병원 내 병원체는 지리적 위치 1-3에 따라 중환자 실 환자에서 두 번째 또는 세 번째 가장 자주 고립 칸디다 종입니다. 계통 발생 학적으로, C. 글라 브라, 반수체 신진 효모, 더 밀접하게 비 병원성 모델 효모 사카로 병원성 칸디다 종보다 사카로 마이 세스 세레 비시에 관련되어 있습니다. C. 포함 알비 칸스 4. 이과 일치, C. 글라 브라는 짝짓기, 분비 단백질 분해 활성과 형태 학적 소성 4-5 등 일부 주요 곰팡이 독성 특성이 부족하다.
비록 C. 글라 브라는 균사를 형성하지 않는, 그것은 생존과 6-8는 고유 발병 메커니즘을 개발했다고 제안 쥐와 인간 대 식세포에 복제 할 수 있습니다. 제한된 정보는 전략에 대해 사용할 수 있는지 C. 글라 브라는 영양이 부족한 세포 대식 세포 환경을 생존과 산화 및 호스트 면역 세포 5 마운트 비산 화성 호스트의 응답을 방해하기 위하여 사용한다. 관련 식세포 모델 시스템은 C.의 상호 작용을 묘사하는 필수 조건이다 기능 유전체 및 단백체 접근 방식을 통해 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 및 인간 및 뮤린 기원의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)는 각각 이전 C.의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다 숙주 면역 세포 7,9와 글라 브라. 그러나, PBMC를하고 BMDMs를 얻기 어려움, 제한된 수명과 다른 포유 동물의 기증자들 본질적인 변화는 이러한 세포의 활용으로 다양한 모델의 시스템을 제한합니다.
여기에서, 우리는 intracellul을 연구하는 생체 시스템의 구축 방법을 설명합니다C. 아칸소 동작 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 파생 된 대 식세포에서 글라 브라 셀. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 쉽게 호스트 곰팡이 병원균 상호 작용의 다양한 측면을 연구하기 위해 조작 할 수있는 간단하고 저렴한, 빠르고, 재생 가능한 세포 배양 모델 시스템을 제정했다.
THP-1 세포는 이전에 박테리아, 바이러스, 진균 등 10-12 병원균의 광범위한 대 숙주 면역 반응을 해독하는데 사용되어왔다. 단핵구 THP-1 세포는 유지 관리가 용이하고 인간의 단핵구 유래 대 식세포를 모방하고 적절한 대식 세포 마커 (13)를 표현하는 대 식세포에, 포르 볼 에스테르 처리에 따라 차별화 할 수 있습니다. THP-1 대식 모델 시스템의 주요 이점은 사용의 용이성 및 정교한 장비의 요구 사항의 부족이다.
여기에 제시된 프로토콜은 HOS 다른 사람의 곰팡이 병원균의 상호 작용을 연구하기 쉽게 적응할 수있다면역 세포를 톤. 현재의 절차는 또한 고 스루풋 돌연변이 스크린을 사용하여 관심의 병원체에 대한 독성 요소를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 증명의 개념은 인간 대 식세포에서 8 C. 글라 브라의 생존에 필요한 유전자 (56)의 집합을 식별하는 THP-1 배양 모델 시스템의 성공적인 사용에 의해 예시되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
선천성 면역계는 편의적 진균 감염의 조절에 중요한 역할을한다. 대 식세포는 섭취와 곰팡이 병원균의 파괴에 의해 방어 항진균제에 기여한다. 따라서, 생존 및 / 또는 대 식세포의 항균 기능을 반작용에 필요한 요인의 해명은 곰팡이 독성 전략에 대한 우리의 이해를 진행합니다. 이러한 상황에서, 우리는 인간 편의적 진균 병원체 C.의 상호 작용을 특성화하기 위해 인간 단구 세포주 TH…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은, 생명 공학, 인도, DNA 지문 및 진단을위한 센터의 핵심 자금의 정부 부서의 혁신적인 젊은 Biotechnologist 상 BT/BI/12/040/2005 및 BT/PR13289/BRB/10/745/2009 보조금에 의해 지원되었다 하이 데 라 바드. MNR 및 GB는 주니어와 마니 팔 대학의 박사 학위의 추구를 향한 과학 산업 연구위원회의 선임 연구 장학금의 수혜자입니다. SB는 마니 팔 대학의 박사 학위를 추구으로 주니어 공학학과의 수석 연구 활동의받는 사람입니다.
Materials
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
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