Summary

Istituzione di un<em> In vitro</em> Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em> Candida glabrata</em> In umani THP-1 macrofagi

Published: December 10, 2013
doi:

Summary

L'attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l'interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine.

Abstract

Un sistema cellulare modello di coltura, se un vicino mimo di condizioni ambientali ospitanti, può servire come un'alternativa economica, riproducibile e facilmente manipolabile per sistemi modello animale per lo studio di una fase specifica di infezione microbica patogeno. Una linea cellulare monocitica umana THP-1 che, al momento phorbol trattamento estere, è differenziato in macrofagi, è già stata utilizzata per studiare le strategie di virulenza di molti patogeni intracellulari, tra cui Mycobacterium tuberculosis. Qui, discutiamo un protocollo di emanare una cellula in vitro modello di cultura sistema che utilizza THP-1 macrofagi per delineare l'interazione di un opportunista lievito Candida glabrata agente patogeno umano con fagociti host. Questo sistema modello è semplice, veloce, suscettibili di schermi mutanti high-throughput, e non richiede attrezzature sofisticate. Un tipico esperimento THP-1 infezione dei macrofagi richiede circa 24 ore con un ulteriore 24-48 ore per permettere intracellulare recuperatolievito di crescere su terreno ricco di formanti colonia analisi fattibilità basato su unità. Come altri sistemi modello in vitro, un possibile limite di questo approccio è la difficoltà di estrapolare i risultati ottenuti da una circuiteria cellule immunitarie altamente complesso esistente nell'ospite umano. Tuttavia, nonostante questo, l'attuale protocollo è molto utile per chiarire le strategie che un patogeno fungino può utilizzare per eludere / contrastare risposta antimicrobica e sopravvivere, adattarsi e proliferare in un ambiente povero di nutrienti delle cellule immunitarie dell'ospite.

Introduction

Specie di Candida sono la principale causa di infezioni fungine invasive potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi 1. Candida glabrata, un patogeno nosocomiale emergente, è il secondo o il terzo più frequentemente isolati specie di Candida da pazienti nell'unità di terapia intensiva a seconda della posizione geografica 1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, un lievito in erba aploidi, è più strettamente legato alle Saccharomyces non lievito modello patogeno cerevisiae che a patogeni Candida spp. tra cui C. albicans 4. Coerentemente con questo, C. glabrata manca di alcune caratteristiche di virulenza fungine chiave, tra cui l'accoppiamento, attività proteolitica secreto e la plasticità morfologica 4-5.

Sebbene C. glabrata non forma ife, può sopravvivere e riprodursi nei macrofagi murini ed umani 6-8 suggerendo che essa ha sviluppato meccanismi di patogenesi unici. Sono disponibili informazioni limitate circa le strategie che C. glabrata impiega per sopravvivere nell'ambiente intracellulare dei macrofagi poveri di nutrienti e contrastare ossidativo e risposte dell'ospite nonoxidative montati da ospite cellule immunitarie 5. Un pertinente modello di sistema dei macrofagi è un prerequisito per delineare l'interazione di C. glabrata con fagociti host tramite approcci di genomica e proteomica funzionale. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e macrofagi derivate dal midollo osseo (BMDMs) di origine umana e murina, rispettivamente, sono prima stati utilizzati per studiare l'interazione di C. glabrata con ospite cellule immunitarie 7,9. Tuttavia, la difficoltà nell'ottenere PBMC e BMDMs, la loro durata di vita limitata e la variazione intrinseca tra i diversi donatori mammiferi limitano l'utilizzo di queste cellule sistemi modello come versatili.

Qui, descriviamo un metodo per la creazione di un sistema in vitro per studiare la intracellulcomportamento ar di C. cellule glabrata in macrofagi derivati ​​dalla linea cellulare monocitica umana THP-1. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di sistema di coltura cellulare semplice, poco costoso, veloce e riproducibile che può essere facilmente manipolato per studiare diversi aspetti di interazione ospite-patogeno fungino.

Cellule THP-1 sono stati precedentemente utilizzati per decifrare la risposta immunitaria contro una vasta gamma di agenti patogeni quali batteri, virus e funghi 10-12. Monocitaria THP-1 le cellule sono di facile manutenzione e possono essere differenziati, previo trattamento esteri phorbol, ai macrofagi che imitano i macrofagi derivate da monociti di risorse umane ed esprimono adeguatamente i marcatori macrofagi 13. I principali vantaggi di THP-1 sistema modello macrofagi sono la facilità d'uso e la mancanza di sofisticate apparecchiature requisito.

Il protocollo qui presentato è facilmente adattabile a studiare l'interazione di altri patogeni fungini umani con host cellule immunitarie. L'attuale procedura può anche essere impiegato per identificare i fattori di virulenza per l'agente patogeno di interesse utilizzando schermi mutanti alto rendimento. Questa prova di concetto è stato esemplificato dal successo nell'uso di THP-1 sistema modello di coltura per identificare un insieme di 56 geni che sono necessari per la sopravvivenza di C. glabrata in macrofagi umani 8.

Protocol

Si consiglia di eseguire C. glabrata esperimenti di infezione in un laboratorio con livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2). Preparazione di THP-1 macrofago monostrato. Preparazione di C. sospensione cellulare glabrata. Infezione di cellule THP-1 macrofagi con C. cellule glabrata. Misurazione della frequenza fagocitosi e replicazione intracellulare tramite unità formanti colonie saggio. Monitoraggio della replica…

Representative Results

Infezione analisi di PMA trattati THP-1 macrofagi con C. tipo selvatico glabrata (wt), le cellule hanno rivelato che le cellule wt stati fagocitati dai macrofagi ad un tasso del 55-65% dopo 2 ore coincubation. Inoltre, C. glabrata cellule erano in grado di resistere uccisione da parte THP-1 macrofagi ed hanno subito un moderato 5 – a 7 volte maggiore CFU dopo 24 ore di coculturing con THP-1 macrofagi 8. Replica intracellulare di cellule di tipo selvatico, trasformate con GF…

Discussion

Sistema immune innato svolge un ruolo importante nel controllo delle infezioni fungine opportunistiche. I macrofagi contribuiscono alla difesa antimicotici per ingestione e la distruzione del patogeno fungino. Così, delucidazione di fattori che sono necessari per la sopravvivenza e / o contrastare le funzioni antimicrobiche di macrofagi avanzerà la nostra comprensione delle strategie di virulenza fungine. In questo contesto, abbiamo stabilito un sistema cellulare modello vitro in coltura utilizzando macrofagi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da Innovative Giovane Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 e BT/PR13289/BRB/10/745/2009 concessione dal Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell'India e dei fondi fondamentali del Centro per l'impronta digitale del DNA e diagnostica, Hyderabad. MNR e GB sono i destinatari di Junior e Senior Research Fellowships del Consiglio di ricerca scientifica e industriale verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell'Università Manipal. SB è il destinatario di Junior e Senior Research Fellowship del Dipartimento di Biotecnologie verso il perseguimento di un dottorato di ricerca dell'Università Manipal.

Materials

THP-1 American Type Culture Collection TIB 202 Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640 Hyclone SH30096.01 For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich P 8139 Caution: Hazardous
YPD  BD-Difco 242710 For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS) Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)  Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium Vector Labs H-1200 For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP JONAKI-BARC LCP-102 For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes Corning 430167 To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate Corning 3527 To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide BD Falcon REF354104 To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer Rohem India For enumeration of cells
Table top microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 18 For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge Remi R-8C For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer Amersham Biosciences Ultraspec 10 To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator Labtech Refrigerated To grow C. glabrata cells
Shaker incubator New Brunswick Innova 43 To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator Thermo Electron Corporation Forma series 2 To culture THP-1 cells
Confocal microscope Carl Ziess Ziess LSM 510 meta  To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope Olympus CKX 41 To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine BioRad  DNA Engine To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven Labnet Problot 12S For hybridization 
PhosphorImager Fujifilm FLA-9000 For scanning hybridized membranes
Thermomixer Eppendorf Thermomixer Comfort For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit Alphainnontech Alphaimager To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels

References

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Rai, M. N., Borah, S., Bairwa, G., Balusu, S., Gorityala, N., Kaur, R. Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages. J. Vis. Exp. (82), e50625, doi:10.3791/50625 (2013).

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