JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Geautomatiseerde High-throughput Behavioral Analyses in zebravis Larven

Published: July 04, 2013
doi:
10.3791/50622
,
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry,Brown University

Summary

Ons laboratorium ontwikkelde een nieuwe high-throughput geautomatiseerde imaging systeem dat nuttig is voor de detectie van verschillende gedragingen in 7 dagen oude zebravis larven. Het systeem kan worden gebruikt voor het detecteren van subtiele veranderingen in het gedrag na de larven zijn blootgesteld aan milieu-toxische stoffen of geneesmiddelen.

Abstract

We hebben een nieuwe high-throughput imaging systeem ontwikkeld voor de analyse van het gedrag in 7 dagen oude zebravis larven in multi-lane platen. Dit systeem meet spontane gedrag en de reactie op een aversieve stimulus, waarvan is aangetoond dat de larven via een PowerPoint-presentatie. De opgenomen beelden worden geanalyseerd met ImageJ macro die automatisch splitst de kleurkanalen, trekt de achtergrond en past een drempel voor individuele larven plaatsing in de lanen identificeren. We kunnen vervolgens importeren de coördinaten in een Excel-sheet te zwemmen snelheid, voorkeur voor rand-of zijkant van de rijbaan, het rusten gedrag, thigmotaxis, afstand tussen de larven en vermijdingsgedrag kwantificeren. Subtiele veranderingen in gedrag zijn gemakkelijk gedetecteerd met behulp van ons systeem, waardoor het nuttig voor gedragsanalyses na blootstelling aan het milieu toxische stoffen of geneesmiddelen.

Introduction

Zebravis worden steeds een populair model voor genetische, ontwikkelings-en gedragswetenschappen 1-4. Zij broeden uit hun chorions met 2-3 dagen na de bevruchting (DPF), ontwikkelen van volledig functionerende organen met 4-5 dpf, en vertonen een groot aantal gedragingen door 7 dpf 5,6. Zebravis larven zijn uitermate geschikt voor hoge-doorvoer analyse vanwege hun kleine omvang 7,8. Software is commercieel beschikbaar voor geautomatiseerde analyses van het gedrag in de larvale en volwassen zebravis 9-14. Dit kan echter software duur en heeft beperkte mogelijkheden voor het meten van complex gedrag van zebravis larven in multi-well platen.

We hebben een nieuwe high-throughput imaging systeem dat goedkoop op te zetten en kan een aantal verschillende gedragingen in 7 DPF zebravis larven 15,16 kwantificeren. Het systeem kunnen we subtiele gedragsafwijkingen snel en efficiënt testen na embryonale blootstelling aan een aantalfarmaceutica en milieu toxische stoffen 16-18.

Het systeem is gebouwd met houten kasten, welk huis een digitale camera aan de bovenkant van de kast. De camera kijkt naar beneden naar de bodem van de kast waar een laptop wordt geplaatst met het scherm naar boven 15. Time lapse beeldvorming wordt gebruikt om de plaatsing van de larven in de lanen vangen. Larven kunnen worden ondergebracht in vier multi-well of meerdere rijstroken platen die boven op de laptop scherm. We maken gebruik van een PowerPoint-presentatie als een aversieve stimulus waarop de larven reageren door af te stappen (vermijding) en zwemmen naar de rand (thigmotaxis) 15,17. De afbeeldingen worden ingevoerd in ImageJ waarin een automatische macro wordt gebruikt om de kleurkanalen splitsen, aftrekken van de achtergrond, en een drempel voor individuele larven identificeren passen. Coördinaten worden weergegeven voor elke larve in elk beeld en in een Excel-bestand, die we gebruiken om te vermijden en thigmota gekwantificeerd kunnen worden ingevoegdXIS gedrag, vis tot afstand, zwemmen snelheid, en de hoeveelheid rust 16.

Protocol

1. Collectie van zebravis embryo's en Raising Larven Glazen Pyrex gerechten met "fake" grass (gemaakt van groene garen) (figuur 1) dient om de zebravis embryo's te verzamelen in de tanks worden ingebracht bij zonsopgang en links in twee uur. De glazen platen met de embryo's worden uitgegoten over een handheld zeef en gespoeld met gedeïoniseerd water. De embryo's worden vervolgens gekweekt in eieren water. Het ei water bevat 60 mg / L van Instant Ocean in gedeïoniseerd water en 0,25 mg / L methyleenblauw, die wordt gebruikt als mal inhibitor. Afhankelijk van de hypothese van het individuele experiment, kunnen embryo's onmiddellijk of tijdens specifieke fasen van ontwikkeling met behulp van toxische stoffen of geneesmiddelen worden behandeld. De toxische stoffen en geneesmiddelen worden meestal opgelost in DMSO (op een 1000 X concentratie) en verder moet direct worden verdund in het ei water medium. Tijdens de embryonale en larvale behandeling met geneesmiddelen of giftige stofs kunnen de larven en embryo's worden ondergebracht in diepe petrischalen met een dichtheid van ongeveer 50-60 larven per 50 ml tot gedragsanalyses op 7 dpf (egg water oplossing moet worden gewijzigd ten minste om de andere dag voor schimmel / bacteriegroei te voorkomen van dode embryo's). 2. Voorbereiding Mallen voor Behavioral Analyses Speciaal ontwikkelde plastic mallen die 11,7 cm meten x 7.6 cm x 5 mm werden op maat gemaakt in eigen huis. De mallen zijn nodig om rijstroken met behulp van agarose die is gegoten in enkele, goed kunststof platen van Thermo Scientific creëren. De single well platen maatregel 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm. De vormen bevatten vijf rijstroken waarbij de zijden een hoek van 60 °. De banen in de mallen 3,5 mm hoog met een basis van 18 mm aan de top die het breedste terwijl de onderste breedte 14 mm. Er is een opening 4 mm tussen banen in de matrijs (figuur 2). Ter voorbereiding van de rijstroken Giet 50 ml gesmolten agarose (0,8% agarose in deioniserend water met 60 mg / L Instant Ocean) in een goed plaat. De matrijs moet dan langzaam bovenop de vloeistof agarose om eventuele belvorming weg worden geplaatst en kan worden verwijderd wanneer de agarose is afgekoeld (die ongeveer 45 minuten duurt). De agarose rijstroken moet worden gemaakt niet eerder dan een dag voor de gedrags-experiment moet worden uitgevoerd (om de agarose uitdroging te voorkomen) De rijstroken kan bij kamertemperatuur worden bewaard met de deksels op de gerechten tot ongeveer 36 uur. De agarose lanen alleen worden gebruikt voor een experiment en moet dan worden weggegooid. 3. Fotolader Tot 20 larven kunnen worden geplaatst in elke baan van de platen. Typisch 5 larven per rijstrook worden gebruikt om de meest nauwkeurige volgen van zwemmen snelheid vergemakkelijken en het aantal larven dat nodig is per experiment verminderen. De banen kunnen worden gevuld met ei water met of zonder geneesmiddelen of toxische stoffen afhankelijk van het experiment. Toch moet lanen niet filled al de weg totdat ze worden geplaatst in de beeldvorming kabinetten, dit zal voorkomen overflow. Voor de consistentie, dient de larven een acclimatisatie periode van tien minuten hebben nadat ze in de agarose mallen worden geplaatst en boven op de laptop scherm. Efficiënt de larven verplaatsen van de petrischaal op de agarose rijstrook zal helpen om larven stress te verminderen. Dit is het gemakkelijkst wanneer de larven zijn ondergebracht in ondiepe tanks of petrischaaltjes. De imaging-kasten voorzien van een digitale camera van Canon gebruikt voor time-lapse fotografie en een laptop. De camera moet aan de bovenkant van de kast geplaatst en gericht naar de bodem van de kast waar een 15,6 inch scherm laptop worden geplaatst scherm omhoog (figuur 3). Vier platen worden geplaatst met de hand direct op het scherm van de laptop. Op dit moment de doorgangen kan worden afgewerkt met ei water of chemische behandeling om het niveau met de bovenkant van de baan (bij effect bereiken de randen van het lAnes in de beelden). Een PowerPoint-presentatie wordt gebruikt als een aversieve stimulus voor de larven. In het verleden bewegende rode ballen werden getoond aan larven zebravis in 6 of 12 multi-well platen 15,17,18. De huidige PowerPoint begint met een blanco witte achtergrond voor 15 min, gevolgd door 15 min van een bewegende rode balk op de bovenste helft van de plaat (figuur 4). Teneinde oververhitting van de larven op te heffen, is het het beste om een ​​laptop te kopen met een scherm temperatuur die niet meer bedraagt ​​dan 28 ° C. Om verdamping van de vloeistof in de agarose lanes voorkomen, moet de maximale imaging bewaard blijven dan een uur. De digitale camera moet worden geprogrammeerd voor time-lapse fotografie, foto's maken om de 6 seconden voor een totaal van 300 beelden per experiment. Echter, de frequentie en de lengte worden aangepast afhankelijk van het experiment en gedragsmatige kwantificering. In het verleden uitgebreide imaging tijden werden tewerkgesteld met langere intervallen tussen elke afbeelding. De camereen kan worden ingesteld op een lagere resolutie voor weergave op video snelheid (30 frames per seconde). Terwijl de lagere resolutie beperkt de opnamen op een enkele plaat met meerdere putjes, de video-opnamen zijn geschikt voor beeldvorming snelle zwemmen gebeurtenissen 15. 4. Beeldanalyse De beelden moeten worden geopend met ImageJ en gebruikt met een macro die specifiek in-house geschreven. De macro splitst automatisch de kleur kanalen, zodat de rode kleur kan worden verwijderd, trekt de achtergrond, geldt een drempel, en identificeert de larven door de analyse van deeltjes. De meest actuele macro voor vijf rijstrook larvale analyse is Zebrafish_macro25k. Gebruik de aanwijzingen in de macro aantal afbeeldingen, kleur worden afgetrokken, afbeelding drempel, enz. instellen Nadat alle beelden zijn uitgevoerd door de ImageJ macro, zal een bestand met resultaten worden weergegeven en zal x bevatten, y-coördinaten van de individuele larven voor elk beeld samen met het beeld nummer en het baannummer. </li> De resultaten bestand moet worden opgeslagen in een Excel-formaat en gesorteerd worden op basis van lege achtergrond versus bewegende balk achtergrond en vervolgens het goed nummer. Een Excel sjabloon te gebruiken dat vergelijkingen ingebouwd die automatisch bepaalt plaatsing van larven in de putjes, afstand tussen larven, bewegingssnelheid en hoeveelheid rust is. De meeste huidige Excel-sjabloon wordt 25ib gemaakt in de Creton lab, die op verzoek verkrijgbaar is. Grafieken die verschillende behandelingsgroepen moet in de Excel sheet worden gebouwd, samen met t-toetsen voor vergelijking tussen de behandelingsgroepen en controles. Verdere statistische analyse kan worden uitgevoerd met behulp van SPSS.

Representative Results

In onze eerdere testen met de stuiterende bal aversieve stimulus wildtype larven dat onbehandeld reageert op bewegende bal van zwemmen in de put (vermijdingsgedrag) naar de zijkanten van de put (thigmotaxis gedrag) 15. We later bevestigd dat thigmotaxis gedrag in deze test is een maat van angst in gedrag bij zebravis larven 17. Er waren significante verschillen in de larven beweging van de kogel en voorkeur voor de rand in vergelijking met de blanco witte achtergrond. Deze problemen zijn ook vastgesteld in onze nieuwe assay met de bewegende rode balk en zijn nog robuuster 16. Bovendien kunnen we nu genieten een groter aantal gedragingen in een enkele assay zoals zwemmen snelheid, rust, voorkeur voor eind of zijkant van de put, en de afstand tussen vissen (Figuur 5). Controle larven gekweekt in eieren water tonen een toegenomen voorkeur voor beneden in de schaal en aan de rand van de rijbaan eenfter zij worden aangeboden met een aversieve stimulus (bewegende rode balk). Soortgelijke resultaten worden verkregen wanneer larven worden gekweekt in eieren water dat 1 ug / ml DMSO, een oplosmiddel dat gewoonlijk wordt gebruikt om verschillende geneesmiddelen en toxische ontbinden 1000 X voorraadoplossingen. Representatieve resultaten worden getoond in figuur 5 in larven behandeld met ei water en DMSO (als controles) en variërende concentraties van een organofosforbestrijdingsmiddelen vaak gevonden in niet-biologisch voedsel. De getoonde resultaten zijn een steekproef uit een experiment. Wanneer herhaalde de resultaten aan dat zwemmen snelheid thigmotaxis gedrag veranderd door lage concentraties organofosfaten, die niveaus in voedselconsumptie 18 na te bootsen. Figuur 1. Opvangbakken. Glas Pyrex gerechten worden gebruikt om e verzamelenmbryos van de volwassen vis tanks. Deksels van de Pyrex gerechten werden gesneden en gestoken met kunststof roosters en groene garen werd genaaid op de roosters in het plastic. Dit creëert een voedingsbodem sfeer voor de volwassen zebravissen door het nabootsen van de natuurlijke omgeving. Figuur 2. Plastic vorm en agarose rijstroken. A) De mal wordt weergegeven aan de linkerkant. 0,8% agarose wordt gegoten in een one-wells plaat, wordt de mal langzaam ingebracht en vervolgens verwijderd wanneer de agar is afgekoeld B) De plaat aan de rechterkant toont de rijstroken die in agarose door de plastic mal.. Figuur 3. Imaging Kasten. Imaging kasten waren specially ingebouwd in ons laboratorium en gebruikt voor high-throughput gedragsanalyses. Een 15 megapixel digitale camera is bevestigd aan de bovenkant van de kast naar beneden om tijd lapse beelden van de larven in multilane platen bovenop het scherm van een laptop verzamelen. Tussen de platen en het scherm is er een plastic diffuser die wordt gebruikt om moirepatronen voorkomen in de verzamelde afbeeldingen. Figuur 4. Blanco achtergrond en PowerPoint aversieve stimulus. Dit is de huidige PowerPoint die wordt gebruikt om gedragsveranderingen bij zebravis larven roepen. Het biedt robuuste gedragsverschillen tussen A) de lege achtergrond en B) de bewegende rode balk. Figuur 5. Gedrag gekwantificeerde in de high-throughput assay. Voorbeeld van de gedragingen die worden gekwantificeerd uit onze gedrags-test binnen de Excel sheet die we gebruiken voor x, y-coördinaten van de larven. De witte balken tonen de gegevens van larven blootgesteld aan een lege achtergrond en de rode balken tonen de gegevens van de larven blootgesteld aan de rode bewegende balk in de PowerPoint. De grafieken geven de metingen die zijn verkregen gedragsanalyse A) Percentage larven in de baan, B) Percentage van larven aan het einde van de baan, C) Percentage larven aan de rand van de baan, D) Afstand tussen vis (mm), E) zwemmen snelheid van de larven (mm / min), F) Percentage rest van de larven. In de getoonde grafieken, gegevens uit treatment van larven met DMSO controle en verschillende concentraties van een bestrijdingsmiddel variërend ,001-,1 uM (levels vaak gevonden in de menselijke voeding). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

Terwijl wij voortdurend verbeteren van onze nieuwe gedrags-test, is het altijd nuttig geweest voor de detectie van vermijding en thigmotaxis gedrag in de zebravis larven 15. Veel studies zijn uitgevoerd om de resultaten van de assay optimaliseren, zoals kleur gebruikte stimulus, ideaal aantal larven per rijstrook en lengte van gedrags assay. Voorheen gebruikten we multi-well platen (met 6 of 12 wells) 15,17,18. Echter, onlangs hebben we de nieuwe rijstrook mal om een grotere zwemruimte voor de larven waardoor we een groter aantal gedragsmaatregelen verzamelen in een enkele assay 16 (figuur 5) te creëren gemaakt. Andere modificaties omvatten variaties van de PowerPoint getoond (gewijzigd beweging of lengte assay) en de grootte van de gebruikte lanes (we hebben ook mallen voor smallere rijstroken).

Momenteel is deze high-throughput geautomatiseerd systeem is uniek in zijn vermogen om een ​​groot scala van gedragingen in Zebr metenafish larven tegelijk zoals snelheid, vermijding, nabijheid van andere larven, en thigmotaxis in multi-lane platen. Resultaten kunnen snel worden verkregen en een groot aantal larven kan worden geanalyseerd op het moment van de beeldvorming. Het systeem is zowel goedkoop te bouwen en snel en eenvoudig op te zetten. Een beperking van dit systeem is dat de 3-D bewegingen niet kan worden beoordeeld in de zebravis larven. Geautomatiseerde systemen die volwassen zebravissen volgen hebben de 3-D-capaciteit en kan een breder scala van gedragingen zoals beweging omhoog of omlaag binnen de waterkolom 10,19 identificeren. Een andere beperking is dat ons imaging systeem is momenteel niet geoptimaliseerd voor high-throughput analyses op video snelheid. Video snelheid beeldvorming is mogelijk bij het ​​instellen van de camera naar een lagere resolutie 15, maar dit beperkt de analyse van een enkele plaat.

In met de nieuwe "lane"-methode, verschillende delen van de test moest worden uitgevoerd op een nauwkeurige wijze. Bij het plaatsen van de larven in tHij rijstroken, is het essentieel om ervoor te zorgen dat het vloeistofniveau is zeer ondiep totdat de platen boven op de laptop scherm. Als de rijstroken te vol vloeistof, de larven ontsnappen in de omtrek van de plaat. Bovendien, bij het plaatsen van de matrijs in de agarose, zorg moet worden genomen om de matrijs te verlagen langzaam. Als de mal te snel geplaatst, zal luchtbellen ontstaan ​​in de agarose en worden geïdentificeerd door de Image J macro als extra larven. Het is aangeraden dat als de agarose rijstroken hebben zelfs een paar bubbels, is het het beste om nieuwe te maken.

In de toekomst willen we onze gedrags test te optimaliseren om andere complexe gedragingen zoals het leren in de zebravis larven te analyseren en te onderzoeken hoe het leren kan worden beïnvloed door blootstelling aan giftige stoffen en farmaceutische producten in de vroege ontwikkeling. We zijn momenteel bezig met testen die nuttig zijn voor de analyse van leergedrag waarin de gedrags resultaten kunnen vergemakkelijken bepalen welke hersengebieden zijn kunnenbeïnvloed door bepaalde giftige stoffen of geneesmiddelen tijdens de ontwikkeling. Geautomatiseerde assays ontwikkeld voor het meten leergedrag in zebravis larven 20 en deze assays kunnen voor high-throughput screening amendabel worden met de robuuste vermijdingsreactie in multi-lane platen.

Wij stellen voor dat deze gedrags assay kan worden gebruikt in toekomstige studies voor het testen van de effecten op de ontwikkeling van een groot aantal geneesmiddelen en toxische stoffen. Dergelijke studies zou een schat aan informatie te verstrekken over specifieke risicofactoren en dragen bij tot het instellen van een betere gezondheid en veiligheidsrichtlijnen voor zwangere vrouwen en kinderen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Sean Pelkowski voor hulp bij het optimaliseren van de gedrags-assay. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Child Health and Human Development, R01 HD060647 en het National Institute of Environmental Health Sciences, F32 ES021342 en R03 ES017755.

Materials

Reagent
Instant Ocean That Pet Place 198262
Agarose Fisher BP1356-100
Methylene Blue That Pet Place 214325
Equipment
One well plates Fisher 12-565-493
Digital camera Canon EOS Rebel T1i
Imaging Cabinets WoodCraft Towers
Laptops Acer Aspire Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
Camera Lens Canon EF-S 55 – 250 mm f/4.0 – 5.6 IS zoom lens
Plastic diffuser Pendaflex 52345
Software
PowerPoint 2010 Microsoft
ImageJ NIH http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010 Microsoft
Statistical software SPSS 20
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects. Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).
  2. Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).
  3. Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).
  4. Levin, E. D., Cerutti, D., Buccafusco, J. J. Ch. 15. Methods of behavioral analysis in neuroscience. , (2009).
  5. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
  6. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  7. Kokel, D., Bryan, J., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).
  8. Rihel, J., Prober, D. A., et al. Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation. Science. 327, 348-351 (2010).
  9. Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).
  10. Cachat, J., Stewart, A., et al. Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior. PLoS ONE. 6, e17597 (2011).
  11. Sledge, D., Yen, J. Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity. Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).
  12. Stewart, A., Wu, N. Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).
  13. Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits. Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).
  14. Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities. J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).
  15. Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).
  16. Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae. Unpublished observations. , (2012).
  17. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).
  18. Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Neurotoxicol. Teratol. , (2012).
  19. Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).
  20. Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. . Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).

Tags

High-throughputBehavioral AnalysisZebrafish LarvaeSpontaneous BehaviorAversive StimulusImageJSwim SpeedThigmotaxisAvoidance BehaviorEnvironmental ToxicantsPharmaceuticals

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (77), e50622, doi:10.3791/50622 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image