En Tetracyklin-reglerade cellinje ger hög-titer lentivirusvektorer som specifikt riktar dendritiska celler
Summary
Här använder vi retroviral transduktion och concatemeric transfektion att skapa en cellinje som kan uttrycka komponenterna i en lentivirusvektor (LV) i frånvaro av tetracyklin. Denna LV kodar GFP och är pseudotypade med ett glykoprotein, SVGmu, vilken är specifik för en receptor på dendritiska celler.
Abstract
Lentivirusvektorer (LVS) är ett kraftfullt sätt att leverera genetiskt material till många typer av celler. På grund av oro för säkerheten i samband med dessa härledda HIV-1 vektorer, som producerar stora mängder LVS är utmanande. I denna uppsats redovisar vi en metod för att producera höga titrar av själv-inaktiverande LVS. Vi transducera retroviralt tet-off stabila producerande cellinjen GPR att generera en cellinje, GPRS, som kan uttrycka alla virala komponenter, som en dendritisk cell-specifikt glykoprotein, SVGmu. Sedan använder vi concatemeric DNA-transfektion för att transfektera LV överföringen plasmid som kodar för en GFP reportergen i kombination med en selekterbar markör. Flera av de resulterande klonerna kan producera LV på en titer 10-faldigt högre än vad vi uppnår med transient transfektion. Plus, dessa virus transducerar effektivt dendritiska celler in vitro och generera ett starkt T-cell immunsvar mot vår reporter antigen. Denna metod kan vara ett bra alternativ for att producera starka LV-baserade vaccin för kliniska studier av cancer eller infektionssjukdomar.
Introduction
Många vektor har utvecklats för gen leverans. Vektorer baserade på lentiviruses har varit bland de mest studerade viralt system. Dessa vektorer är fördelaktiga eftersom de effektivt kan omvandla både dela och icke-delande celler 1, uppnå långsiktig uttryck på grund av integrering i den mottagande genomet, uppvisar låg naturlig anti-vektor immunitet i de flesta befolkningsgrupper 2, och har en låg potential för genotoxicitet från insertionsmutationer 3,4.
Produktionen av lentiviruses har alltid varit färgad av oro för säkerheten. Lentiviral vektorer är i allmänhet härledda från HIV-1, det etiologiska medlet för AIDS. Transient transfektion av enskilda komponenter i lentivector (överföring, kuvert, och plasmider förpackning) är ett gemensamt och flexibelt sätt att leverera genetiskt material i laboratoriemiljö. Dock är uppskalning transienta transfektioner för kliniska tillämpningar besvärliga och may leda till utveckling av replikationskompetenta lentivirus 5,6. För att övervinna dessa hinder, har flera stabila förpackningar och producerande cellinjer utvecklats 6-11. En av dessa linjer, GPR förpackningslinjen 11, har den attraktiva fördelen att regleras av tetracyklin. I denna uppsats visar vi hur man kan anpassa detta system för att producera själv inaktiverande lentivirusvektorer som är specifikt riktade mot dendritiska celler (DC-LVS) 12.
Dendritiska celler (DC) är de mest robusta antigenpresenterande celler i immunsystemet. De har varit föremål för stort intresse för cancervaccin utveckling eftersom de direkt initiera, program, och reglera tumörspecifika immunsvar 13. Innehåller en vaccinationsprotokollet att inkludera DCs har potential att framkalla en starkare Antitumor immunsvar än peptid eller DNA vacciner. Nyligen, har vi utvecklat en lentivirusvektor som specifically mål dendritiska celler genom en modifierad Sindbisvirus glykoprotein, SVGmu 14. Dessa vektorer är unika i att de visar hög specificitet för dendritiska celler och generera starkare immunsvar än icke-specifika, VSVG-pseudotypade vektorer.
Här rapporterar vi en metod för att producera stora mängder av dessa DC-riktade lentivirala vektorer. Vi visar att dessa DC-LVS kan infektera DCs och generera starka CD8 + T-cell immunsvar. Alla som deltar i djurförsök utfördes humant, enligt godkännande av USC Intitutional Animal Care och användning kommittén. För att utföra in vivo och kliniska experiment, är det viktigt att skapa en cellinje som kan producera virus vid en hög titer. Utföra transduktionen och transfektion steg exakt enligt beskrivningen ska maximera chanserna att generera en sådan klon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi sammanställt en metod för att producera stora mängder av lentivirusvektorer med 293T celler stabilt transducerats med alla lentivirala komponenter under Tet utanför regelsystemet. Hittills de flesta protokoll för att producera lentivirala vektorer förlitar sig på standard kalciumfosfat transient transfektion (se 18, till exempel). Denna strategi har varit framgångsrik på en klinisk nivå, men det kan drabbas av vissa begränsningar som sannolikt inte att vara närvarande i skala upp produ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Michael Chou, Bingbing Dai, och Liang Xiao för bidragande data för detta manuskript. Vi erkänner också Dr John Gray för generösa gåvor av reagenser som används i denna studie. PB stöds av en postdoktorsstipendium från National Cancer Center. Denna forskning har finansierats med bidrag från National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 och RCA170820A), ett bidrag från Bill och Melinda Gates Foundation, en translationell acceleration bidrag från det gemensamma Centrum för Translational Medicine och ett bidrag från California hiv / aids Research Program.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
