Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas
Summary
Aqui, nós utilizamos a transdução retroviral e transfecção concatemeric para criar uma linha celular que possa expressar os componentes de um vector lentiviral (LV) na ausência de tetraciclina. Este LV codifica GFP e é pseudotipado com glicoproteína, SVGmu, que é específico para um receptor em células dendríticas.
Abstract
Lentivirais (VEs) são um poderoso meio de entrega de material genético para muitos tipos de células. Devido a questões de segurança associadas a esses HIV-1 vetores derivados, produzindo grandes quantidades de VEs é um desafio. Neste artigo, apresentamos um método para a produção de altos títulos de LVs auto-inativação. Nós retroviralmente transduzir o produtor estável tet-off linha celular de GPR para gerar uma linha celular, GPRS, que pode expressar todos os componentes virais, incluindo uma glicoproteína específica de células dendríticas, SVGmu. Então, usamos concatemeric transfecção de ADN para transfectar o LV transferência plasmídeo que codifica um gene repórter GFP, em combinação com um marcador seleccionável. Vários dos clones resultantes podem produzir LV com um título de 10 vezes maior do que aquilo que conseguir com transfecção transitória. Além disso, estes vírus eficiente transduzir células dendríticas in vitro e geração de uma forte resposta imunitária das células T ao antigénio a repórter. Este método pode ser uma boa opção for produção de vacinas fortes baseados em LV para os estudos clínicos de câncer ou doenças infecciosas.
Introduction
Muitos sistemas de vectores têm sido desenvolvidos para entrega de genes. Vetores baseados em lentivírus têm estado entre o sistema viral mais comumente estudada. Estes vetores são vantajosos porque podem eficientemente transdução tanto dividindo e não dividindo células 1, alcançar expressão a longo prazo, devido à integração no genoma do hospedeiro, apresentam baixa imunidade natural anti-vector na maioria das populações humanas 2, e têm um baixo potencial de genotoxicidade de mutagénese insercional 3,4.
Produção de lentivírus sempre foi colorida por questões de segurança. Lentivirais são geralmente derivados de HIV-1, o agente etiológico da AIDS. Transfecção transiente de componentes individuais do lentivector (transferência, o envelope, e os plasmídeos de empacotamento) é um meio comum e flexível de fornecimento de material genético em laboratório. No entanto, a ampliação dos transfections transitórios para aplicações clínicas é pesado e may levar ao desenvolvimento de lentivírus replicação competente 5,6. Para ultrapassar estas dificuldades, várias embalagens estáveis e linhas celulares produtoras foram desenvolvidos 6-11. Uma destas linhas, a linha de embalagem de GPR 11, tem a vantagem de ser atraente regulada por tetraciclina. Neste artigo, vamos demonstrar como adaptar este sistema para produzir auto-inativando lentivirais que são especificamente voltados para as células dendríticas (DC-VEs) 12.
As células dendríticas (CDs) são o antigene mais robustas que apresentam as células do sistema imunitário. Eles têm sido objecto de grande interesse no desenvolvimento de vacinas contra o cancro, porque eles iniciam directamente, programa e regular as respostas imunológicas específicas do tumor 13. A incorporação de um protocolo de vacinação de incluir DCs tem o potencial para provocar uma resposta imune antitumoral mais forte do que as vacinas de ADN ou de péptidos. Recentemente, desenvolvemos um vetor lentivírus que specifically como alvo as células dendríticas através de uma glicoproteína do vírus Sindbis modificado, SVGmu 14. Estes vetores são os únicos que mostram alta especificidade para as células dendríticas e gerar respostas imunes mais fortes do que inespecíficos, vetores VSVG-pseudotipado.
Aqui, apresentamos um método para a produção de grandes quantidades desses lentivirais DC-alvo. Nós demonstramos que estas DC-VEs podem infectar DC e gerar fortes de células T CD8 + respostas imunes. Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de forma humana, sob a aprovação do USC Intitutional Animal Care e do Comitê Use. A fim de realizar experiências in vivo e clínica, que é crítico para criar uma linha de células que podem produzir o vírus a um título elevado. Executar as etapas de transdução e transfecção exatamente como descrito irá maximizar as chances de gerar um tal clone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos um processo para a produção de grandes quantidades de vectores lentivirais que utilizam células 293T transduzidas estavelmente com todos os componentes sob a lentivirais tet off sistema regulador. Até à data, a maioria dos protocolos para a produção de vectores lentivirais dependem de fosfato de cálcio padrão de transfecção transiente (ver 18, por exemplo). Esta abordagem tem sido bem sucedida em escala clínica, mas pode sofrer de algumas limitações que não possam estar p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Michael Chou, Bingbing Dai, e Liang Xiao para contribuir com dados para este manuscrito. Também reconhecemos Dr. John Gray para os generosos presentes de reagentes utilizados neste estudo. PB é apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do Centro Nacional do Câncer. Esta pesquisa foi suportada por concessões do National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 e RCA170820A), uma bolsa da Fundação Bill e Melinda Gates, uma bolsa de aceleração translacional do Centro Conjunto de Medicina Translacional e uma bolsa da Califórnia HIV / AIDS Programa de Pesquisa.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
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