En Tetracyclin-regulert Cell Linje Produserer Høy titer lentiviral vektorer som spesifikt retter dendrittiske celler
Summary
Her anvendes retroviral transduksjon og concatemeric transfeksjon for å skape en cellelinje som kan uttrykke komponentene i en lentiviral vektor (LV) i fravær av tetracyklin. Dette LV koder GFP og er pseudotyped med et glykoprotein, SVGmu, som er spesifikk for en reseptor på dendrittiske celler.
Abstract
Lentiviral vektorer (LVS) er et kraftig middel til å levere genetisk materiale til mange typer celler. På grunn av sikkerhetsmessige bekymringer knyttet til disse HIV-1 avledet vektorer, som produserer store mengder LVS er utfordrende. I denne artikkelen rapporterer vi en metode for å produsere høy titer av selv-inaktivere LVS. Vi retrovirally transduce Tet-off stabil produsent cellelinje GPR å generere en cellelinje, GPRS, som kan uttrykke alle de virale komponenter, inkludert en dendrittiske celle-spesifikk glykoprotein, SVGmu. Deretter bruker vi concatemeric DNA transfeksjon å transfektere LV overføring plasmid koding en reporter gen GFP i kombinasjon med en valgbar markør. Flere av de resulterende klonene kan produsere LV ved en titer 10 ganger høyere enn hva vi oppnå med forbigående transfeksjon. I tillegg er disse virusene effektivt transduce dendrittiske celler in vitro og generere en sterk T-celle immunrespons mot vår reporter antigen. Denne metoden kan være et godt alternativ for fremstilling av sterke LV-baserte vaksiner for kliniske studier av cancer eller smittsomme sykdommer.
Introduction
Mange vektor systemer har blitt utviklet for genet levering. Vektorer basert på lentiviruses har vært blant de mest studerte viral system. Disse vektorer er fordelaktig fordi de effektivt kan transduce både delende og ikke-delende celler 1, for å oppnå langvarig ekspresjon på grunn av integrering i vertsgenomet, utviser lav naturlig anti-vektor immunitet i de fleste humane populasjoner 2, og har et lavt potensial for gentoksisitet fra innsettingen mutagenese 3,4.
Produksjon av lentiviruses har alltid vært farget av sikkerhetsmessige hensyn. Lentiviral vektorer er generelt avledet fra HIV-1, det etiologiske middel for AIDS. Forbigående transfeksjon av enkelte komponentene i lentivector (overføring, konvolutt og emballasje plasmider) er en vanlig og fleksibel måte å levere genetisk materiale i laboratoriet. Imidlertid er oppskalering forbigående transfections for kliniske applikasjoner tungvint og may føre til utvikling av replikering-kompetente lentivirus 5,6. For å overvinne disse hindringene, har flere stabile emballasje og produsent cellelinjer blitt utviklet 6-11. En av disse linjene, GPR pakkelinjen 11, har den fordelen av å være attraktive regulert av tetracyklin. I denne artikkelen viser vi hvordan du kan tilpasse dette systemet til å produsere selv-inaktivere lentiviral vektorer som er spesielt rettet mot dendrittiske celler (DC-LVS) 12.
Dendrittiske celler (DCS) er de mest robuste antigenpresenterende celler i immunsystemet. De har vært gjenstand for stor interesse i kreft vaksineutvikling fordi de direkte initiere, program og regulere tumor-spesifikke immunresponser 13. Består av et vaksinasjon protokollen til å inkludere DCs har potensial til å lokke fram en sterkere antitumor immunrespons enn peptid eller DNA-vaksiner. Nylig har vi utviklet en lentiviral vektor som specifically mål dendrittiske celler gjennom en modifisert sindbis virus glykoprotein, 14 SVGmu. Disse vektorer er unike ved at de viser høy spesifisitet til dendrittiske celler og generere sterkere immunresponser enn uspesifikke, VSVg-pseudotyped vektorer.
Her rapporterer en metode for fremstilling av store mengder av disse DC-målrettede lentiviral vektorer. Vi viser at disse DC-LVS kan infisere DCs og generere sterke CD8 + T-celle immunrespons. Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført humant, under godkjenning av USC Intitutional Animal Care og bruk Committee. For å utføre in vivo eksperimenter og klinisk, er det avgjørende for å skape en cellelinje som kan produsere virus i høy titer og. Utføre transduksjon og transfeksjon skritt nøyaktig som beskrevet vil maksimere sjansene for å generere en slik klone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi skissert en metode for å produsere store mengder lentiviral vektorer ved hjelp 293T celler stabilt transduced med alle lentiviral komponentene under tet utenfor regelverket. Til dags dato, de fleste protokoller for å produsere lentiviral vektorer stole på standard kalsiumfosfat transient transfeksjon (se 18, for eksempel). Denne tilnærmingen har vært vellykket på en klinisk skala, men det kan lide noen begrensninger ikke sannsynlig å være til stede i skalere opp produksjonen fra stabile cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Michael Chou, Bingbing Dai, og Liang Xiao for å bidra data for dette manuskriptet. Vi erkjenner også Dr. John Gray for de sjenerøse gaver av reagenser som brukes i denne studien. PB er støttet av en postdoktorstilling fra National Cancer Center. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 og RCA170820A), et stipend fra Bill og Melinda Gates Foundation, en translasjonell akselerasjon stipend fra Joint Center for translasjonell medisin og et stipend fra California HIV / AIDS Research Program.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
