Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen
Summary
Wir verwenden hier retrovirale Transduktion und Transfektion konkatemeren eine Zelllinie, die die Komponenten eines lentiviralen Vektors (LV) in der Abwesenheit von Tetracyclin Ausdruck zu erstellen. Das LV kodiert GFP und mit einem Glykoprotein, SVGmu, die spezifisch für einen Rezeptor auf dendritischen Zellen pseudotypisiert.
Abstract
Lentiviralen Vektoren (LVs) sind ein mächtiges Mittel zur Bereitstellung von genetischem Material, viele Arten von Zellen. Wegen Sicherheitsbedenken mit diesen HIV-1 abgeleiteten Vektoren verbunden sind, große Mengen von LVs ist eine Herausforderung. In diesem Beitrag berichten wir über ein Verfahren zur Herstellung hohe Titer von Selbst-inaktivierende LVs. Wir retroviral transduzieren das tet-off stabilen Erzeuger-Zellinie GPR eine Zelllinie, GPRS, die alle viralen Komponenten, einschließlich einer dendritische Zellen spezifische Glykoprotein SVGmu Ausdruck erzeugen kann. Dann verwenden wir konkatemeren DNA Transfektion zur Transfektion der LV Transferplasmid Codierung ein Reportergen GFP in Kombination mit einem Selektionsmarker. Einige der resultierenden Klone können LV mit einem Titer 10-fach größer als das, was mit der transienten Transfektion erreichen erzeugen. Außerdem diese Viren effizient transduzieren dendritischen Zellen in vitro und erzeugen eine starke T-Zell-Immunantwort zu unserem Reporter-Antigen. Diese Methode kann eine gute Option sein, for Herstellung starke LV-basierte Impfstoffe für klinische Studien von Krebs oder Infektionskrankheiten.
Introduction
Viele Vektor-Systeme für den Gentransfer entwickelt worden. Vektoren auf Basis von Lentiviren haben unter den am häufigsten untersuchten viralen System gewesen. Diese Vektoren sind vorteilhaft, weil sie effizient Transduktion sowohl sich teilende und nicht teilende Zellen 1, eine langfristige Expression durch die Integration in das Wirtsgenom, weisen eine geringe natürliche Anti-Vektor-Immunität in den meisten menschlichen Populationen 2 und haben ein geringes Potenzial für Genotoxizität von Insertionsmutagenese 3,4.
Produktion von Lentiviren wurde stets von Sicherheitsbedenken wurde gefärbt. Lentivirale Vektoren sind in der Regel von HIV-1, dem Erreger von AIDS abgeleitet. Die transiente Transfektion von einzelnen Komponenten des lentivector (Transfer, Umschlag und Verpackung Plasmide) ist eine häufige und flexible Mittel zur Bereitstellung von genetischem Material in Labor-Einstellungen. Allerdings ist Scaling-up transienten Transfektionen für klinische Anwendungen schwerfällig und may für die Entwicklung von Replikations-kompetente lentivirus 5,6 führen. Um diese Hürden zu überwinden, wurden mehrere stabile Verpackung und Produzent Zelllinien 6-11 entwickelt. Eine dieser Linien, die GPR Verpackungslinie 11, hat den Vorteil, dass sie attraktiv durch Tetracyclin reguliert. In diesem Beitrag zeigen wir, wie man dieses System anzupassen, um selbst-inaktivierenden lentiviralen Vektoren, die speziell auf dendritische Zellen (DC-LVs) 12 sind gezielt zu erzeugen.
Dendritische Zellen (DCs) sind die robust Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Sie haben das Thema von großem Interesse in der Krebs-Impfstoff-Entwicklung, weil sie direkt initiieren, Programm und regulieren Tumor-spezifische Immunantworten 13. Die Aufnahme einer Impfung Protokoll gehören DCs hat das Potenzial, eine stärkere Immunantwort als Antitumor-Peptid oder DNA-Impfstoffe zu entlocken. Vor kurzem haben wir einen lentiviralen Vektor entwickelt, specifically zielt dendritischen Zellen durch eine modifizierte Sindbisvirus Glykoprotein, SVGmu 14. Diese Vektoren sind einzigartig, weil sie eine hohe Spezifität für dendritische Zellen zeigen und erzeugen stärkere Immunantwort als unspezifische, VSVg-pseudotypisierten Vektoren.
Hier berichten wir über ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen dieser DC-bezogene lentiviralen Vektoren. Wir zeigen, dass diese DC-LVs können DCs infizieren und erzeugen starke CD8 + T-Zell-Immunantwort. Alle Verfahren, die Tiere wurden artgerecht, unter Zustimmung des USC Intitutional Animal Care und Use Committee durchgeführt. Um in vivo und klinische Versuche durchzuführen, ist es wichtig, eine Zelllinie, die Viren mit einer hohen Titer produzieren zu erstellen. Die Durchführung der Transduktion und Transfektion Schritte genau wie beschrieben maximiert die Chancen der Erzeugung eines solchen Klons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir ein Verfahren zur Herstellung großer Mengen von lentiviralen Vektoren mit 293T-Zellen, die stabil transduzierten mit allen lentiviralen Komponenten unter der tet off Regelungssystem beschrieben. Bisher stützen sich die meisten Protokolle lentiviralen Vektoren zu erzeugen auf Standard-Calciumphosphat transiente Transfektion (siehe 18, beispielsweise). Dieser Ansatz ist erfolgreich auf einem klinischen Maßstab, aber es kann von einigen Einschränkungen nicht vorhanden sein können bei der Ausw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Michael Chou, Bingbing Dai, und Liang Xiao für einen Beitrag für diese Handschrift erkennen. Wir erkennen auch Dr. John Gray für die großzügigen Gaben der Reagenzien in dieser Studie verwendet. PB wird durch ein Postdoc-Stipendium von der National Cancer Center unterstützt. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health (R01AI68978, P01CA132681 und RCA170820A), einen Zuschuss von der Bill and Melinda Gates Foundation, eine translatorische Beschleunigung Zuschuss aus dem Joint Center for Translational Medicine und einen Zuschuss von der California HIV / AIDS unterstützt Research Program.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
