خط خلية التتراسيكلين التنظيم وتنتج ناقلات lentiviral عالي عيار التي تستهدف على وجه التحديد خلايا الجذعية
Summary
هنا، ونحن نستخدم تنبيغ فيروسات وترنسفكأيشن concatemeric لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تعبر عن مكونات ناقلات lentiviral (LV) في غياب التتراسيكلين. هذا LV بترميز GFP وpseudotyped مع بروتين سكري، SVGmu، والتي هي محددة لمستقبلات على الخلايا الجذعية.
Abstract
ناقلات lentiviral (لفس) هي وسيلة قوية لإيصال المادة الوراثية لأنواع عديدة من الخلايا. بسبب مخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بهذه ناقلات المستمدة HIV-1، وتنتج كميات كبيرة من لفس يمثل تحديا. في هذه الورقة، ونحن التقرير وسيلة لإنتاج التتر عالية من لفس-تعطيل الذاتي. نحن retrovirally تنبيغ تيت حالا الخلية المنتجة مستقرة خط GPR لتوليد خط الخلية، جي بي آر إس، والتي يمكن أن تعبر عن جميع مكونات الفيروسية، بما في ذلك بروتين سكري خلية محددة شجيري، SVGmu. ثم، ونحن نستخدم ترنسفكأيشن الحمض النووي concatemeric ل transfect نقل LV ترميز البلازميد GFP الجينات مراسل في تركيبة مع علامة اختيار. العديد من الحيوانات المستنسخة مما يمكن ان تنتج LV في عيار 10 أضعاف أكبر من ما نحقق مع ترنسفكأيشن عابرة. بالاضافة الى ذلك، هذه الفيروسات تنبيغ كفاءة الخلايا الجذعية في المختبر، وإنشاء خلية T استجابة مناعية قوية للمستضد مراسلنا. قد يكون هذا الأسلوب FO خيار جيدR إنتاج اللقاحات قوية قائمة على LV للدراسات السريرية للسرطان أو أمراض معدية.
Introduction
وقد تم تطوير العديد من أنظمة ناقلات لتوصيل الجينات. وكانت الناقلة على أساس lentiviruses بين نظام الفيروسية الأكثر شيوعا درس. هذه النواقل هي مفيدة لأنها يمكن أن تنبيغ بكفاءة سواء بتقسيم وغير تقسيم الخلايا 1، وتحقيق التعبير على المدى الطويل بسبب الاندماج في الجينوم المضيف، يحمل منخفض الطبيعية الحصانة مكافحة النواقل في معظم المجتمعات البشرية 2، ولها قدرة منخفضة على السمية الجينية من الطفرات غرزي 3،4.
كان دائما الملونة إنتاج lentiviruses بواسطة مخاوف تتعلق بالسلامة. وتستمد ناقلات lentiviral عموما من HIV-1، والعامل المسبب لمرض الإيدز. ترنسفكأيشن عابرة من المكونات الفردية للlentivector (نقل، مغلف، والبلازميدات التعبئة والتغليف) هو وسيلة مشتركة ومرنة لإيصال المادة الوراثية في بيئة معملية. ومع ذلك، ورفع مستوى transfections عابرة للتطبيقات السريرية هي مرهقة وأماهY يؤدي إلى تطوير الفيروسة البطيئة النسخ المتماثل المختصة 5،6. للتغلب على هذه العقبات، وقد وضعت العديد من التعبئة والتغليف وخطوط الخلية مستقرة المنتجة 6-11. واحد من هذه الخطوط، خط التعبئة والتغليف GPR 11، لديه ميزة جذابة من يجري تنظيمها من قبل التتراسيكلين. في هذه الورقة، ونحن لشرح كيفية التكيف مع هذا النظام لإنتاج تعطيل الذاتي ناقلات lentiviral التي تستهدف على وجه التحديد نحو الخلايا الجذعية (DC-لفس) 12.
الخلايا الجذعية (DCS) هي الأكثر قوة مستضد تقديم الخلايا في الجهاز المناعي. وقد كانت موضع اهتمام كبير في تطوير لقاح السرطان لأنها تشرع مباشرة، برنامج، وتنظيم الاستجابات المناعية ورم محددة 13. دمج بروتوكول التطعيم لتشمل البلدان النامية لديه القدرة على استثارة استجابة مناعية أقوى انتيتومور من اللقاحات الببتيد أو الحمض النووي. مؤخرا، قمنا بتطوير ناقلات lentiviral أن specificallY يستهدف الخلايا الجذعية من خلال بروتين سكري فيروس سندبيس تعديل، SVGmu 14. هذه النواقل هي فريدة من نوعها من حيث أنها تظهر خصوصية عالية للخلايا الجذعية وتوليد استجابات مناعية أقوى من غير محدد، ناقلات VSVG-pseudotyped.
هنا، ونحن التقرير وسيلة لإنتاج كميات كبيرة من هذه ناقلات lentiviral DC-المستهدفة. علينا أن نظهر أن هذه DC-لفس يمكن أن تصيب البلدان النامية وتولد قوية CD8 + T خلية الاستجابات المناعية. تم تنفيذ كافة الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات بطريقة إنسانية، بموجب موافقة من USC Intitutional رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. من أجل أداء في التجارب المجراة والسريرية، فمن الأهمية بمكان لإنشاء خط الخلية التي يمكن أن تنتج فيروس في آن وعيار عالية. وتنفيذ الخطوات تنبيغ وترنسفكأيشن تماما كما هو موضح تعظيم فرص توليد هذا استنساخ.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، لدينا الخطوط العريضة لطريقة لإنتاج كميات كبيرة من ناقلات lentiviral باستخدام 293T الخلايا ترانسدوسيد ثابت مع جميع المكونات lentiviral تحت تيت قبالة نظام التنظيمية. حتى الآن، معظم بروتوكولات لإنتاج ناقلات lentiviral الاعتماد على معيار فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن عابرة (انظر <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه مايكل تشو، بينغ بينغ داي، ويانغ شياو للمساهمة بتقديم البيانات لهذه المخطوطة. ونحن نعترف أيضا الدكتور جون غراي لهدايا سخية من الكواشف المستخدمة في هذه الدراسة. معتمد من قبل PB زمالة ما بعد الدكتوراه من المركز الوطني للسرطان. وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة (R01AI68978، P01CA132681 وRCA170820A)، منحة من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، منحة تسريع متعدية من المركز المشترك للطب بالحركة ومنحة من كاليفورنيا فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز برنامج البحوث.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
