שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח
Summary
הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.
Abstract
מחקרים של מנגנוני פתוגנזה הסלולר של שמרים פתוגניים כגון קנדידה אלביקנס, capsulatum Histoplasma, וneoformans Cryptococcus להעסיק זיהום של מארחים יונקים או תאים מארחים (כלומר מקרופאגים) ואחריו כימות שמרים באמצעות מושבה להרכיב יחידת ניתוח או cytometry זרימה בדרך כלל. בעוד ספירת יחידת המושבה להרכיב כבר את השיטה הנפוצה ביותר בתחום, יש לו טכניקה זו חסרונות ומגבלות, כולל צמיחה איטית של כמה מיני פטריות על תקשורת מוצקה ויעילות ציפוי נמוכה ו / או משתנה, וזה מדאיג במיוחד כאשר משווה צמיחה של זני הבר מסוג והמוטציה. cytometry הזרימה יכול לספק מידע כמותי לגבי כדאיות שמרים מהיר, לעומת זאת, האימוץ של גילוי תזרים cytometric לשמרים פתוגניים היה מוגבל למספר סיבות מעשיות הכולל עלות הגבוהה שלה ושיקולי biosafety. הנה, אנחנו מדגימים מבוססי תמונההמתודולוגיה cytometric באמצעות חזון Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) לכימות של שמרים פתוגניים קיימא בשיתוף התרבות עם מקרופאגים. המחקרים שלנו להתמקד בזיהוי של שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח'. capsulatum colonizes מקרופאגים מכתשיים ידי שכפול בתוך phagosome מקרופאג, והנה, אנו כמותית להעריך את הצמיחה של ה שמרי capsulatum ב264.7 מקרופאגים RAW באמצעות acridine כתום / מכתים יודיד propidium בשילוב עם cytometry תמונה. השיטה שלנו בנאמנות מגמות צמיחה כפי שהיא נמדדת על ידי משחזרת מושבה מסורתית ויצרה ספירת יחידה, אבל עם רגישות מוגברת באופן משמעותי. בנוסף, אנו ישירות להעריך זיהום של מקרופאגים לחיות עם זן ה-GFP-לבטא של ג אלביקנס. המתודולוגיה שלנו מציעה אמצעי מהיר, מדויק וחסכוני לאיתור וכימות של פתוגנים פטרייתי אדם חשובים בשנינות העמותהתאי מארח h.
Introduction
מחקרים של פטריות פתוגניים בשיתוף עם המארחים ו / או תאי מארח שלהם לעתים קרובות דורשים כימות של תאים פטרייתיים קיימא לאורך זמן או כמובן בתנאי זיהום שונים. ספירה של יחידות מושבה להרכיב (CFU) היא השיטה הסטנדרטית שבו מספר התאים פטרייתיים קיימא כבר נמדד, לעומת זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות ומגבלות. ראשית, הרבה מיני פטריות הם בצמיחה איטית. צמיחה של מושבות גלויות על תקשורת מוצקה יכולה לקחת 1-2 שבועות, להאט את קצב המחקר באופן משמעותי. שנית, מניפולציה של דגימות במהלך ציפוי CFU היא תהליך מייגע, שכן כמה דילולים חייבים להיות מצופה על מנת להבטיח מספר מנייה של מושבות. שלישית, מספר CFU הוא בדרך כלל נמוך יותר ממספר אורגניזמים קיימא מצופים בגלל יעילות הציפוי היא גם מתחת ל -100%. לדוגמה, ביעילות ציפוי לcapsulatum Histoplasma הפתוגן פטרייתי דימורפית יכולה להיות גבוהה ככל 90%, אך באופן שגרתי הן נמוכות כמו30% והם נמוכים אף יותר (10%) לdimorph brasiliensis הקשור פטרייתי Paracoccidioides 1, 2. ציפוי יעיל לקנדידה אלביקנס כפוף גם לשונות 3. לבסוף, ניתוח CFU מהווה רק תאי חיים ופעילים המסוגלים חלוקת ביסוס צמיחה על תקשורת מוצקה, ואילו במצבים רבים, זה יהיה שימושי כדי לקבוע את הנוכחות והריכוז של תאים מתים שאינם פעילים ו / או חילוף חומרים.
בעבר, שיטות תזרים cytometric לכימות של כמה מיני פטריות פתוגניים תוארה 4-6. עם זאת, בשל בעיות בלימת biosafety מעורבות עם השימוש בפתוגנים BSL3 ברמת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) או על cytometers זרימה משותף, האימוץ של טכניקה זו היה מוגבל. כמו cytometry הזרימה, cytometry התמונה הוא שיטה רגישה ומהירה של תא כימות. עם זאת, ניתן לבצע cytometry תמונה בכל חלק של העלות עם תוצאות דומות 7 –11. כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע cytometry תמונה של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח. אנו מדגימים את השיטות שלנו באמצעות שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח'. capsulatum הוא פתוגן פטרייתי דימורפית שגורם למחלות בדרכי הנשימה, בבני אדם, שהוא גדל שמרי ניצנים וכמשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים קנדידה אלביקנס הוא מין commensal אדם שלעתים גורם לקנדידה.. אנו מראים כי cytometry התמונה מאפשרת כימות מהירה של שמרים אלה, יחד עם יכולת הדמיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
cytometry התמונה מאפשרת למשתמש ללכוד תמונות באיכות גבוהות, ובאמצעות תוכנה מיוחדת, לבצע כימות מהירה של תאים. אתגר אחד פוטנציאל לאימוץ cytometry תמונה בתחום פתוגנזה של חיידקים הוא שהחיידקים שנספרו נמצאים באוכלוסייה מעורבת של תאים, כולל תאי מארח יונקים. כאן, אנו מראים כי cytometry ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
