عزل الخلايا العصبية الحسية من<em> Aplysia californica</em> للحصول على التسجيلات المشبك التصحيح من التيارات الجلوتاميرجي
Summary
نحن تصف تشريح الجهاز العصبي من الأرنب البحر البحرية<em> Aplysia</em> بعد التخدير، وعزل الخلايا العصبية للثقافة الأجل القصير الأنسجة، وتسجيلات لاحد التيارات ايون خلية عبر تقنية المشبك التصحيح.
Abstract
البحرية بطني الأرجل الرخويات Aplysia californica لديها تاريخ الجليلة كنموذج من وظيفة الجهاز العصبي، مع أهمية خاصة في دراسات التعلم والذاكرة. التحضيرات نموذجية لمثل هذه الدراسات هي تلك التي يتم ترك الحسية والعصبونات الحركية سليمة في تشريح الحيوان الحد الأدنى، أو تفصيلا تقنيا العصبية الثقافة المشتركة الحسي للفرد والعصبونات الحركية. أقل شيوعا هو إعداد الخلايا العصبية معزولة في الذي مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية المتجانسة أبعاده هي نأت إلى خلايا مفردة في الثقافة على المدى القصير. مثل هذه الخلايا المعزولة هي مفيدة لتوصيف البيوفيزيائية من التيارات أيون باستخدام تقنيات المشبك التصحيح، وتعديل المستهدفة من هذه المواصلة. يوصف بروتوكول لإعداد مثل هذه الثقافات. بروتوكول يستفيد من التعرف عليها بسهولة الخلايا العصبية الحسية الجلوتاميرجي من العقد الجنبي والشدق، ويصف التفكك والحد الأدنى من الصيانة طثقافة ن لعدة أيام دون المصل.
Introduction
كان الرخوي opistobranch البحرية، Aplysia، وهذا نموذج العصبية الحيوية مفيدة لعدة عقود. ومن المعروف أنها نموذج من التعود وتكييف الكلاسيكية 7، 8. فاز دراسات عن التعلم والذاكرة في هذا النموذج على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 2000 لاريك كاندل R.، في الجائزة التي تقاسمها مع أرفيد كارلسون وبول غرينغارد 10. دراسات شملت التسجيلات الكهربائية من انخفاض الاستعدادات، التي يتم تشريح عناصر الجهاز العصبي من هذه اللافقاريات من الحيوان مع الأعصاب والعضلات غادر المرفقة، وقد ساعدت توضيح أدوار الخلايا العصبية الفردية في Aplysia. تحديد الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشكل التعلم في Aplysia ومع ذلك، غالبا ما تستخدم أسلوب آخر، على المدى الطويل المشترك الثقافات من الخلايا العصبية الحسية والعصبون الحركي، التي تم الحصول عليها واحدا تلو الآخر من الحيوانات المانحة الفردية وسمح لتشكيل المشبك في صحن الثقافة 21 .
نحن وغيرنا 1، 3، 6، 14، 15، 16 لقد استغل السهولة التي تم تحديدها يمكن استهداف الخلايا العصبية في هذا النموذج، وكذلك قدرتهم على التحمل في تجارب طويلة الأمد لجعل الثقافات المدى القصير فصلها من مجموعات من الخلايا العصبية المتجانسة أبعاده التي ندرس التيارات الأيونية تحت المشبك الجهد في تكوين المشبك التصحيح. العديد من الخلايا العصبية Aplysia الوقوف في جولات متكررة من التصحيح لقط لإتاحة الوقت للالتلاعب التجريبية طويلة الأمد. هذه التقنية مفيدة للخلايا العصبية مثل الخلايا الإفرازية العصبية كيس من العقدة في البطن، والخلايا العصبية الحسية في العقد الجنبي والشدق التي تفارق وصفنا هنا، ولكن ليس لالخلايا العصبية كبيرة جدا> 60 ميكرومتر في القطر، مثل L7 أو R2 من العقدة في البطن. نحن لا توظف Aplysia المصل في ثقافاتنا، على عكس الحسية العصبون الحركي المشترك الثقافات صفه في مكان آخر. ومعظم الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء أن يكون من دون عمليات لركان أول الموارد البشرية 48 في الثقافة، وتسهيل كامل الخلية تسجيل الجهد، ولكن بعد ذلك سوف تنبت وبلورة المحاور وغيرها من العمليات لحوالي 14 يوما قبل أن يموت من نقص المواد الغذائية و / أو عوامل النمو.
هذه التقنية تنتج الثقافات الأولية من 50-100 الخلايا العصبية في طبق من مناطق موثقة من الناحية الفسيولوجية من العقد الشدق والجنبي. هذا البروتوكول هو مفيد للباحثين دراسة جوانب من علم وظائف الأعضاء خلية واحدة في التجارب التي تتطلب العديد من التجارب مكررات لكل حيوان. وتنتج زوج متطابق من الثقافات بسبب الفصل التشريحي للخلايا المستهدفة في hemiganglia اليسار واليمين، والسماح الدراسات التي تستفيد من العلاج الملائمة والثقافات السيطرة.
بروتوكول يستهدف الشدق S الكتلة (BSC) الخلايا العصبية من العقدة الشدق، والجنبي ventrocaudal (PVC) الخلايا العصبية من العقدة الجنبي. هذه الخلايا هي الحجم المناسب للتسجيلات كله جهد الخلية وrobus العرضر استجابات الجلوتاميرجي. المنهجية التي نوقشت هي مناسبة لمعظم العقد في الجهاز العصبي Aplysia.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقنيات تفارق الموصوفة هنا تسفر الثقافات الخلايا العصبية الحسية التي تحتوي على الخلايا العصبية معزولة 50-100 تتخللها أعداد صغيرة من الخلايا الدبقية والخلايا الأخرى مجهولة الهوية. الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي المرة تبقى العقد في حل الانزيم، والتحريك، وتفار?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة P40 OD010952، ومؤسسة Korein، في جامعة ميامي زمالة إلى SLC وزمالة مايتاغ إلى ATK. المؤلفين الامتنان موظفي الموارد الوطنية للAplysia، وكذلك لورين Simonitis وهانا بيك، الذين قدموا الميكروسكوب لشخصية.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
References
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
