Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.
Bu darbeli, kızılötesi lazer ışık hedef doku arasında herhangi bir başka değişiklik bağımsız olarak, sinir dokusu elektrik yanıtları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, son yıllarda gösterilmiştir. Kızılötesi sinir uyarımı işitsel sinir nöronların uyarılması gösterilen özel bir ilgi ile, in vivo periferik ve duyusal sinir dokusu çeşitli rapor edilmiştir. INS bu ayarları çalışmak gösterilmiştir Ancak,, kızılötesi ışık sinir uyarım neden olan mekanizma (veya mekanizmaları) şu anda iyi anlaşılmış değildir. Burada sunulan protokol kültürlenmiş birincil işitsel nöronlar içinde kızılötesi sinir stimülasyonu soruşturma kolaylaştırmak için tasarlanmış bir bütün hücre yama kelepçe yöntem açıklanır. İyice kontrollü şartlar altında in vitro kızılötesi lazer aydınlatma için bu hücrelerinin yanıtı ile karakterize, bu temel Physica geliştirilmiş bir anlaşılmasını sağlamak için mümkün olabilirl ve biyokimyasal süreçleri kızılötesi sinir stimülasyonu altında yatan.
Nörofizyoloji ve tıbbi biyonik alanlarında nöral dokuda elektrik tepkilerin kontrol uyarılması izin teknikleri temeline dayanmaktadır. Elektrik stimülasyonu sinir uyarım olarak altın standart olmaya devam ederken sinir yanıtları, ve doku 1 çevredeki içine akım yayılmasını nedeniyle stimülasyon özgüllük eksikliği kaydederken, bu tür stimülasyon eserler varlığı gibi sakıncaları bir dizi çekiyor.
Son yirmi yılda optik aracılı stimülasyon teknikleri 2 gelişimi gördük. Bu tekniklerin bazıları ya da belirli bir molekülün eklenmesi (kafesli moleküller) 3 ya da bir araştırma ayarı dışında uygulamak kolaydır ikisi de genetik manipülasyon çeşit (örneğin optogenetik, 4) vasıtasıyla, hedef doku değişiklik gerektirir. Özellikle ilgi çekici bu nedenle kızılötesi sinir stimülasyonu (INS), whereb olduğuy sinir doku darbeli kızılötesi lazer ışık heyecanlı. INS sinir doku 2 çok özel, temassız stimülasyon sağlayarak elektrik stimülasyonu eksikliklerin birçok üstesinden gelmek için potansiyeline sahiptir. INS başarılı in vivo ayarları çeşitli gösterilmiştir Ancak,, uyarma mekanizması tam olarak bilinmese kalır.
Bazı yeni yayınlar 5-7 INS arkasındaki mekanizma ortaya çıkarılması doğru ilerleme göstermiştir. Su ile lazer ışığının emilimi nedeniyle hızlı ısıtma önemli bir rol oynar. Ancak, bunun ötesinde bir fikir birliği henüz ulaşmış olmaktır. Shapiro ve ark. 7 hızlı bir ısıtma ve daha sonra hücre zarı depolarizasyon kapasitans bir değişime yol açan, hücre zarı bitişik yüklü parçacıklar dağılımı içinde bir karışıklık sebep olur, son derece genel mekanizma önerilmiştir. Buna ek olarak, Albert ve arkadaşları. 5 olduğu iddia LASEr kaynaklı ısıtma iyonlarının hücre zarından geçmesine izin, ısıya duyarlı iyon kanalları (geçici reseptör potansiyeli vanilloid kanal), belirli bir sınıf aktive eder. Bu aşamada tespit edilmesi henüz daha faktörler olup olmadığını gerçekten bu mekanizmaların bir araya nasıl belirsiz, ya da.
Bir yayın az sayıda (referans 5,7-9), in vitro incelenmiştir INS olmasına rağmen, bu alanda yayınlanan çalışma bölgesinin büyük bir kısmı (örneğin, referans 1,6,10-18) in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. Işitsel sinirlerin Kızılötesi uyarılması koklear implant 10,14-18 içinde potansiyel uygulamaları nedeniyle özel bir ilgi alanı olmuştur. In vivo deneyler, çeşitli ortamlarda teknik, in vitro çalışmalar tarafından sağlanan kontrol artan seviyesi Mech daha detaylı bir anlayış yol açması beklenmektedir etkililiğini doğrulamak için önemli olmakla birlikte,INS sorumlu olarak tarif etmişler. Bu rapor ayrıca, işitsel sistemin mevcut verilerin büyük gövdesine bağlantı sırasında temel mekanizmaları incelemek için kullanılabilir olarak, yama kelepçe araştırmalar için kültürlenmiş spiral ganglion nöronlarının hazırlanmasını tarif etmektedir.
Yama kelepçe tekniği tek hücrelerinde elektriksel aktivite kayıt aracı sağlayan ve bireysel temel akımları 19 katkısı eğitim, elektrofizyolojik olayların araştırmalar için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, kültür spiral ganglion nöronları gibi birincil nöronların, in vitro hazırlanmasında istikrarlı uygulandığında, bu derinlik sinirsel aktivite kontrol ve manipüle edildiği mekanizmaları eğitim için bir fırsat sunuyor.
Yama kelepçe ile spiral ganglion nöronları elektriksel özellikleri üzerine lazer stimülasyon etkisini araştırmak için bu çalışma taslak yöntemleri belirtilen protokollerikayıtları. Yaklaşım standart mikroskop konfigürasyonu değiştirmek için gerek kalmadan güvenli operasyon gibi kolay ve tekrarlanabilir uyum sağlayan, daha çok bir boş-alan lazer daha fiber çiftli lazer dayanmaktadır. Bu protokollerin dayanarak, daha açık bir şekilde INS arkasında mekanizmasında veya mekanizmalarında belirlemek için deneyler geniş bir yapmak mümkün olmalıdır.
Bu yazıda belirtilen protokolleri kullanarak ayıklamak ve kültür spiral ganglion nöronları ve tüm hücre yama kelepçe deneyler yaparak lazer uyarılmış elektriksel aktivite araştırmak mümkündür. In vitro olarak kullanıldığında, yama klemp tekniği, in vivo olarak ulaşılabilir değildir deney parametreleri üzerinde bir kontrol düzeyi sağlar. Bu dalga boyu, darbe enerjisi, darbe uzunluğu, darbe şekil ve darbe tekrarlama dizileri olarak lazer stimülasyon parametreleri tekrarlana…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Bağlantı Projesi hibe LP120100264 altında Avustralya Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture materials and equipment | |||
Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
Neurobasal media | |||
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
Intracellular solution | |||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Extracellular solution | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
Temperature controller | Warner | TC-324B | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
Table 3.Patch clamp equipment. | |||
1,870 nm laser diode | Optotech | ||
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
Table 4. Laser equipment. |