Summary

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

Published: July 31, 2013
doi:

Summary

赤外線神経刺激は、聴覚系に関連するものを含む神経種類の範囲内の電気刺激の代替として提案されている。このプロトコルは一次聴覚神経細胞の培養における赤外線神経刺激のメカニズムを研究するためのパッチクランプ法を説明しています。

Abstract

なお、パルス、赤外レーザ光が標的組織の更なる変形例の独立した神経組織の電気応答を誘発するために使用することができる近年では実証されている。赤外線神経刺激は、聴覚神経の神経細胞の刺激に示される特定の関心と、in vivoで末梢および感覚神経組織の様々報告されている。 INSは、これらの設定で動作するように示されているがしかし、赤外光は、神経興奮を引き起こすする機構(または機構)は、現在よく理解されていない。ここで紹介するプロトコルは、初代培養ニューロンにおける聴覚赤外線神経刺激の調査を容易にするように設計された全細胞パッチクランプ法が記載されている。十分に制御された条件下でin vitroでの赤外レーザ照射に対するこれらの細胞の応答を特徴付けることで、基本的な物理学会の改善された理解を得ることも可能であるlおよび生化学的プロセスは、赤外線神経刺激の基礎となる。

Introduction

神経生理学や医療バイオニクスの分野では、神経組織の電気応答の制御可能な刺激を可能な技術に大きく依存しています。電気刺激は、神経興奮で金本位まま神経応答、および組織1を取り巻くへの電流の広がりに起因する刺激の特異性の欠如を記録するとき、そのような刺激アーチファクトの存在など多くの欠点に悩まされる。

最後の二十年は、光学的に媒介刺激技術の開発2を見てきました。これらの技術のいくつかは、どちらも、いずれかの特定の分子を添加する( 例えば、ケージ分子)3または遺伝子操作( 例えば、光遺伝学)4のいくつかのフォームを、標的組織の変更を必要とする研究の設定の外側に適用することが容易である。特に興味深いのは、そのため赤外線神経刺激(INS)、wherebですyは神経組織、パルス赤外レ​​ーザ光により励起される。 INSは、神経組織2の高度に特異的な、非接触刺激を可能にすることで、電気刺激の欠点の多くを克服する可能性を秘めている。 INSが正常にin vivoでのさまざまな設定で実証されているがしかし、励起の正確なメカニズムは不明である。

最近の出版物は5-7 INSのメカニズムを解明に向けた進展を示している。水によるレーザ光の吸収による急速加熱が重要な役割を果たすと思われる。しかし、これを超えてコンセンサスがまだ到達しなければならない。シャピロ 7は、急速加熱が、細胞膜およびその後の脱分極の静電容量の変化をもたらす、細胞膜に隣接する荷電粒子の分布の摂動を引き起こすことにより、非常に一般的なメカニズムを提案する。また、アルバート 5はそのLASE ​​を主張rを誘発加熱イオンが細胞膜を通過させ、温度感受性イオンチャネル(一過性受容体電位バニロイドチャネル)の特定のクラスを活性化する。この段階では、これらのメカニズムはまだ同定されている更なる要素があるかどうかを実際に組み合わせる、またはどのように不明である。

出版物の少数の(参考文献5,7-9) インビトロで INSを調査してきたが、この分野で公開され、作業の大部分は( 例えば、参照1,6,10-18) インビボで行われている。聴覚ニューロンの赤外線刺激は人工内耳10,14-18の潜在的なアプリケーションに起因し、特に関心のある領域、となっています。 in vivoでの実験は様々な設定での技術、 試験管内試験ではによって与えられる制御の増加レベルメカのより詳細な理解につながることが期待されての有効性を検証することが重要である一方INSの責任anism。このレポートには、これらも聴覚系から既存データの大本体に連結しながら基本的なメカニズムを研究するために使用することができるように、パッチクランプ調査培養らせん神経節ニューロンの調製を記載する。

パッチクランプ法は、単一細胞における電気的活動を記録する手段を提供し、個々の基礎となる電流19の寄与を研究し、電気生理学的現象の調査のための優れたツールである。この技術は、例えば培養された螺旋神経節ニューロンの一次ニューロンのin vitroにおける安定調製に適用される場合には、深さが神経活性が制御され、操作されるメカニズムを研究する機会を提供する。

パッチクランプを通してらせん神経節ニューロンの電気的特性に及ぼすレーザー刺激の効果を調査するため、この作業のアウトライン法で指定されたプロトコルレコーディング。アプローチは、標準的な顕微鏡の構成を変更することなく安全な操作だけでなく、より簡単かつ再現性の配向を可能にする、ファイバ結合レーザではなく、自由空間レーザに基づいている。これらのプロトコルに基づいて、それがより明確にINSのメカニズムまたは機構を決定するために実験の広い範囲を行うことが可能であるべきである。

Protocol

1。らせん神経節ニューロンの文化オートクレーブ内の小さな丸い( 例えば直径10mm)カバーガラスと湾曲鉗子を滅菌。滅菌ピンセットを用いて、滅菌4リング35ミリメートルペトリ皿または4ウェルプレートの各ウェルに滅菌カバースリップを転送します。最大48時間までのためのインキュベーター(37℃)でカバースリップと場所の上面にポリ-L-オルニチン(500μgの/ ml)とマウ?…

Representative Results

らせん神経節ニューロンは、電圧クランプと電流クランプ記録構成の両方で再現性のある波形のレーザー照射に応答します。 図3aは、2.5ミリ、0.8 mJのレーザーパルス(6から平均応答に応じて、細胞膜を横切る電流の流れの典型的な変化を示している-70 mVで、-60 mVで、-50 mVで開催された膜電位と1秒間隔で繰り返しレーザーパルス、)。ネット内向き電流が一貫した照明が停止した…

Discussion

本論文で概説プロトコルを使用すると、それは抽出して文化らせん神経節ニューロンと全細胞パッチクランプ実験を行うことにより、レーザー誘発電気的活動を調査することが可能である。 インビトロで使用される場合、パッチクランプ法は、 インビボでは達成できない実験パラメータの制御のレベルを提供する。このような波長、パルスエネルギー、パルス長、パルス形状?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、リンケージプロジェクト助成LP120100264下オーストラリアリサーチ評議会によってサポートされていました。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

References

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Cite This Article
Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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