JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Flybar: Amministrazione alcol a Flies

Published: May 18, 2014
doi:
10.3791/50442
, , ,
1Department of Biological Science,Florida State University, 2Department of Biology and Biochemistry, Biology of Behavior Institute,University of Houston

Summary

Drosophila è emersa come sistema modello significativo per la dissezione delle basi cellulari e molecolari delle risposte comportamentali all'alcool. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di dati di sensibilità alcol in un contesto circadiano che può essere facilmente applicato ad altri esperimenti ed è particolarmente adatto per la ricerca di laurea.

Abstract

Moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) sono un modello stabilito sia per la ricerca di alcol e di biologia circadiana. Recentemente, abbiamo dimostrato che l'orologio circadiano modula alcool sensibilità, ma non la formazione di tolleranza. Qui, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio. L'alcol viene somministrato alle mosche con flybar. In questa configurazione, vapori di alcol saturo viene miscelato con aria umidificata in set proporzioni, e somministrato alle mosche in quattro tubi contemporaneamente. Le mosche sono allevati in condizioni standardizzate al fine di minimizzare la variazione tra le repliche. Tre giorni di età in linea di differenti genotipi o trattamenti vengono utilizzati per gli esperimenti, preferibilmente abbinando mosche di due diversi punti di tempo (ad esempio, CT 5 e CT 17) rendendo possibili confronti diretti. Durante l'esperimento, mosche sono esposti per 1 ora alla percentuale prestabilita del vapore di alcool e il numero di mosche che esporre la perdita del riflesso di raddrizzamento (Lorr) o sedzione sono conteggiati ogni 5 min. I dati possono essere analizzati utilizzando tre differenti approcci statistici. Il primo è quello di determinare il momento in cui il 50% delle mosche hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento e utilizzare un analisi della varianza (ANOVA) per determinare se esistono differenze significative tra i punti temporali. Il secondo è quello di determinare le mosche percentuali che mostrano Lorr dopo un determinato numero di minuti, seguita da un'analisi ANOVA. L'ultimo metodo è quello di analizzare l'intera serie di volte con statistica multivariata. Il protocollo può essere utilizzato anche per esperimenti non circadiani o confronti tra i genotipi.

Introduction

Drosophila melanogaster dimostrare risposte comportamentali bifasico all'alcool 1 che sono analoghi a risposte umane a questo farmaco 2,3. Dopo l'esposizione iniziale a basse concentrazioni di alcol, mosche mostra un aumento dell'attività locomotoria, sostituito da una mancanza di coordinazione motoria, la perdita del controllo posturale e raddrizzamento riflessi (perdita del riflesso di raddrizzamento: Lorr), e la sedazione (completa mancanza di attività motoria in risposta alla stimolazione meccanica) come l'esposizione all'alcol progredisce 4-9. L'orologio circadiano endogeno è un modulatore di forte sensibilità alcol e tossicità osservata in topi, ratti 10,11 12, 13 e nell'uomo. I recenti progressi nella ricerca Drosophila hanno mostrato l'orologio circadiano modula la sensibilità acuta da alcol, ma non l'alcol tolleranza 1. I potenti approcci genetici disponibili a Drosophila attraverso studi mutanti e manipolazioni transgeniche di spazialee l'espressione genica temporale fornire un sistema che consente rapidi progressi nell'identificare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di comportamenti complessi. L'uso di Drosophila come strumento di indagine ha consentito progressi sostanziali nella comprensione di alcol neurobiologia che possono essere rapidamente tradotti ai mammiferi 14-16. Al fine di facilitare la comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali l'orologio circadiano modula la sensibilità di alcol e di misurare uniformemente risposte comportamentali attraverso punti di tempo circadiani, un protocollo di somministrazione di alcol adatto per l'uso in condizioni di luce rossa fioca è richiesto. Per Drosophila, l'alcool può essere somministrato attraverso integrazione alimentare per esposizione cronica o affidabile attraverso amministrare alcol in forma di vapore per esposizioni acute. Qui, descriviamo un protocollo di somministrazione alcool adatto per la valutazione della modulazione circadiano di perdita-di-riflesso di raddrizzamento (Lorr) 1 nonchésedazione.

Le mosche sono trascinate con 12 ore: 12 cicli hr LD a temperatura costante e poi trasferiti in un regime di luce controllata per 2-5 giorni a seconda della questione sperimentale. Mosche sono esposti al vapore di etanolo in un dispositivo noto come flybar. In questo dispositivo, quantità controllate di aria vengono gorgogliare attraverso acqua e alcool; i vapori vengono poi mescolati e diretti in un alloggiamento flaconcino in linea. Ogni 5 min in linea sono segnati per il numero che non riesce a visualizzare raddrizzamento riflessi o sono diventati sedato. Percentuali Lorr per ogni punto di tempo vengono calcolati e confrontati tra i punti temporali circadiani o tra ceppi di mosche. La semplicità e l'affidabilità di consegna alcol con la consegna di alcol flybar combinato con le opzioni di analisi comportamentale offre un vantaggio significativo per gli esperimenti circadiani condotti in condizioni di oscurità.

Protocol

1. Assemblea della flybar Motivazione e Panoramica: Il sistema è progettato per amministrare percentuali controllate di vapore di alcol per le mosche. Nota: La figura 1 fornisce una panoramica schematica del flybar set-up come descritto di seguito in tre fasi (assemblaggio del flusso d'aria, set-up della alcol e bottiglie d'acqua, e l'assemblaggio delle fiale di osservazione). In breve, un flusso d'aria costante è diviso in due frazioni che vengono gorgogliar…

Representative Results

Modulazione circadiano di alcol sensibilità con la Lorr 50% come marcatore. Un esempio rappresentativo che mostra modulazione circadiano in alcool sensibilità durante il giorno è presentato in Figura 2. Lorr stata misurata a sei punti di tempo durante il 2 ° giorno di DD in Canton-S e il 50% Lorr stato determinato per ciascun punto di tempo. L'analisi ha dimostrato un effetto significativo del momento della giornata (ANOVA: F 5,45 = 7.39, p<…

Discussion

I costi di abuso di alcol e l'alcolismo per la società è enorme, sia in termini di costi umani ed economici 29 30,31. Drosophila come modello offre un sistema veloce e versatile per esaminare rapidamente le risposte comportamentali di un gran numero di individui e come tale è stato ampiamente utilizzato sia per l'alcol 5,7,32-34 e ricerca circadiano 35-37.

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice per la somministrazione controllata di…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanziamento per questa ricerca è stato fornito da un programma in Neuroscienze Award dalla Florida State University College of Medicine e il sostegno del Dipartimento di Scienze Biologiche a FSU. Il finanziamento aggiuntivo è stato fornito da un Grant-in-Aid dal Fondo di Ricerca di alcol Beverage Produttore.

Materials

Alcohol 190 proof Various
Name of Material Company Catalog Number Comments
Aerator Local pet store We use Whisper 60
Silicone tubing 1/8” VWR 408060-0030
120° Y Connector VWR 82017-256
Quick disconnects VWR 46600-048
Plastic tube clamps Bell-art products 132250000 Either this or next
Miniature Air Regulator McMaster-Carr 8727K11 Either this or previous
Miniature Air Regulator Mounting Bracket McMaster-Carr 9891K66
Gilmont size 12 flow meter VWR 29895-242
Tool clips McMaster-Carr 1722A43 To hold flow meters
Vial VWR 89092-722
Rubber stopper with two holes VWR 59585-186 Fits in vials
5 mm Pyrex Glass tubes Trikinetics PGT5x65 Fits best in previous stopper.
Teflon tape Hardware store To achieve snug fit in stoppers if necessary
Rubber stopper with two holes VWR 59582-122 Fits our bottles
Disposable glass pipets VWR 53283-768 Cut to length and bend by heating
Very fine nylon netting VWR Various
15 watt bulbs Hardware store Overhead red light
Photographic red safe light filters Overhead red light
Mini Flashlights with red filters Mag-light
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Linde, K., Lyons, L. C. Circadian modulation of acute alcohol sensitivity but not acute tolerance in Drosophila. Chronobiol. Int. 28, 397-406 (2011).
  2. Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
  3. Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
  4. Bellen, H. J. The fruit fly: A model organism to study the genetics of alcohol abuse and addiction. Cell. 93, 909-912 (1998).
  5. Guarnieri, D. J., Heberlein, U. Drosophila melanogaster, a genetic model system for alcohol research. International Review of Neurobiology. 54, 203-232 (2003).
  6. Scholz, H. Intoxicated fly brains: Neurons mediating ethanol-induced behaviors. J. Neurogenet. 23, 111-119 (2009).
  7. Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T. Y., Heberlein, U. High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila. J. Neurosci. 22, 11035-11044 (2002).
  8. Schumann, G., Spanagel, R., Mann, K. Candidate genes for alcohol dependence: Animal studies. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 27, 880-888 (2003).
  9. Singh, C. M., Heberlein, U. Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 24, 1127-1136 (2000).
  10. Perreau-Lenz, S., Zghoul, T., de Fonseca, F. R., Spanagel, R., Bilbao, A. Circadian regulation of central ethanol sensitivity by the mPer2 gene. Addiction Biology. 14, 253-259 (2009).
  11. Brager, A. J., Prosser, R. A., Glass, J. D. Circadian and acamprosate modulation of elevated ethanol drinking in mPer2 clock gene mutant mice. Chronobiol. Int. 28, 664-672 (2011).
  12. Sinclair, J. D., Geller, I. Ethanol consumption by rats under different lighting conditions. Science. 175, 1143-1144 (1972).
  13. Danel, T., Jeanson, R., Touitou, Y. Temporal pattern in consumption of the first drink of the day in alcohol-dependent persons. Chronobiol. Int. 20, 1093-1102 (2003).
  14. Kapfhamer, D., et al. Taok2 controls behavioral response to ethanol in mice. Genes, brain, and behavior. 12 (1), 87-97 (2012).
  15. Lasek, A. W., et al. An evolutionary conserved role for anaplastic lymphoma kinase in behavioral responses to ethanol. PLoS One. 6, 226-236 (2011).
  16. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  17. Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning & Memory. 16, 19-27 (2009).
  18. Hamblen-Coyle, M. J., Wheeler, D. A., Rutila, J. E., Rosbash, M., Hall, J. C. Behavior of period-altered circadian-rhythm mutants of Drosophila in ligh-dark cycles (Diptera Drosophilidae). J. Insect Behav. 5, 417-446 (1992).
  19. Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. Reciprocal behavior associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants. J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).
  20. Power, J. M., Ringo, J. M., Dowse, H. B. The effects of period mutations and light on the activity rhythms of Drosophila melanogaster. Journal of Biological Rhythms. 10, 267-280 (1995).
  21. Yoshii, T., et al. Temperature cycles drive Drosophila circadian oscillation in constant light that otherwise induces behavioural arrhythmicity. Eur. J. Neurosci. 22, 1176-1184 (2005).
  22. Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 28, 1469-1480 (2004).
  23. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. Functional ethanol tolerance in Drosophila. Neuron. 28, 261-271 (2000).
  24. Kong, E. C., et al. Ethanol-regulated genes that contribute to ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila. Alcohol Clin Exp Res. 34, 302-316 (2010).
  25. Borycz, J., Borycz, J., Kubow, A., Lloyd, V., Meinertzhagen, I. Drosophila ABC transporter mutants white, brown and scarlet have altered contents and distribution of biogenic amines in the brain. J. Exp. Biol. 211, 3454-3466 (2008).
  26. Sitaraman, D., et al. Serotonin is necessary for place memory in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 5579-5584 (2008).
  27. Bainton, R. J., et al. Dopamine modulates acute responses to cocaine, nicotine and ethanol in Drosophila. Current Biology. 10, 187-194 (2000).
  28. Kong, E. C., et al. A pair of dopamine neurons target the D1-like dopamine receptor DopR in the central complex to promote ethanol-stimulated locomotion in Drosophila. Plos One. 5, (2010).
  29. Xu, J., Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Tejada-Vera, B. . Deaths: Final data for 2007. , (2010).
  30. . The National Center on Addiction and Substance Abuse. Shoveling up II: The impact of substance abuse on federal, state and local budgets. , (2009).
  31. NIAAA, Estimated economic costs of alcohol abuse in the United States. , (1992).
  32. Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Current Biology. 19, 2126-2132 (2009).
  33. Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Communicative & Integrative Biology. 3, 357-359 (2010).
  34. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. The genetics of behavioral alcohol responses in Drosophila. International Review of Neurobiology. 91, 25-51 (2010).
  35. Boothroyd, C. E., Young, M. W., Pfaff, D. W., Kieffer, B. Molecular and Biophysical Mechanisms of Arousal, Alertness, and Attention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1129, 350-357 (2008).
  36. Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Current Biology. 18, 84-93 (2008).
  37. Sheeba, V. The Drosophila melanogaster circadian pacemaker circuit. J. Genet. 87, 485-493 (2008).
  38. Cohan, F. M., Graf, J. -. D. Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance. Evolution. , 278-293 (1985).
  39. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  40. Berger, K. H., et al. Ethanol sensitivity and tolerance in long-term memory mutants of Drosophila melanogaster. Alcohol Clin Exp Res. 32, 895-908 (2008).
  41. Pohl, J. B., et al. Circadian Genes Differentially Affect Tolerance to Ethanol. in Drosophila. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. , (2013).
  42. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33, 1794-1805 (2009).
  43. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, (1016).

Tags

Fruit FliesDrosophila MelanogasterAlcohol ResearchCircadian BiologyAlcohol SensitivityAlcohol ToleranceFlyBarAlcohol VaporLoss Of Righting ReflexSedationStatistical Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
van der Linde, K., Fumagalli, E., Roman, G., Lyons, L. C. The FlyBar: Administering Alcohol to Flies. J. Vis. Exp. (87), e50442, doi:10.3791/50442 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image