Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови ^1. Во время воспаления и инфекции нейтрофилы являются первыми клетками появляются на пораженные места, где они выступают в качестве первой линии обороны ^2. Нейтрофилы обладают антимикробным несколько механизмов ^3, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, выделение литических ферментов дегрануляцию и производство провоспалительных цитокинов ^4,5. Нейтрофилы являются недолговечными клеток, которые получают быстро активировать с помощью сигналов от различных рецепторов клеточной поверхности. Несмотря на то, нейтрофилы были рассмотрены терминала клеток из-за их короткой жизни, а потому, что они подвергаются апоптозу, если активированы во время воспалительного процесса ^6, уже сейчас ясно, что они также могут изменить свой ​​фенотип, изменяя уровень транскрипции определенных генов. Продукции цитокинов ⁵ и ингибирование апоптоза ^7,8 две яmportant-зависимой активации функции клеток регулируется на уровне транскрипции в нейтрофилах. Ядерный фактор кВ (NF-kB) участвует в транскрипционным контролем цитокинов ^{4 производственных} и в регулировании выживания клеток и апоптоз ^9-11 в различных типах клеток.

Сигнальных путей, которые ведут к ядерному активация фактора, как правило, изучаются анализы гена-репортера или сдвига электрофоретической подвижности анализы (EMSA). Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнена с анализа гена-репортера, поскольку нет эффективных методов для нейтрофилов трансфекции. EMSA анализы были использованы в нейтрофилах, чтобы исследовать ядерный фактор активации ^12,13, однако эта методология является сложной и дорогой, потому что она включает в себя использование радиоактивных материалов. Nucleofection является еще одним методом, который был использован successfuLLY для трансфекции моноциты ^14. Таким образом, по крайней мере в теории, ядерной активация фактора могут быть обнаружены в нейтрофилах путем трансфекции (несмотря на низкую эффективность). Однако, этот метод был бы более дорогим, отнимающим много времени и, вероятно, менее количественные. Микроскопический анализ иммуноокрашиванию клетки могут быть также использованы для обнаружения ядерных факторов в ядре. Действительно, мы обнаружили NF-kB транслокации в ядро таким образом ^15. К сожалению, этот метод также времени, меньше количественных и с учетом смещения наблюдателя.

Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки через интегрины или Fc рецепторов с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализ с помощью проточной цитометрии (Figure 1). Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB ¹⁵ и Elk-1 ¹⁶ ядерных факторов нейтрофилов ядер. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения в ядерных уровней фактора в ядре. Этот метод также может быть использован для анализа уровня факторов транскрипции в ядрах от других типов клеток.