Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing
Summary
Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.
Abstract
Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Mikrobiyoloji uygulamaları için pyrosequencing avantajları hızlı ve güvenilir yüksek verimli tarama ve mikropların ve mikrobiyal genom mutasyonlarının doğru tanımlama içerir. Pyrosequencing sentezi, reaksiyon sırasında dahil edilen özel bir nükleotid varlığının belirlenmesinde, tamamlayıcı dizi bir seferde tek bir baz sentez ile DNA sekanslama içerir. Reaksiyon dört deoksiribonükleotit (dNTP) arka arkaya ilave edildi ve adi dNTP sentez tepkimesi için bir sonraki dNTP eklenmesinden önce enzimatik olarak bozulmuş olan vardır immobilize tek sarmallı DNA şablonu üzerinde oluşur. Şablonu dahil belirli bir baz Algılama chemilum üretimi ile izlenirinescent sinyalleri. Kemilüminesan sinyalleri üretmek dNTP sırası şablon DNA dizisi belirlenir. Pyrosequencing teknolojinin gerçek zaman sıralaması özelliği tek bir tahlil hızla mikrobiyal tanımlanmasını sağlar. Buna ek olarak, pyrosequencing alet, SNP, nokta mutasyonları, eklemeler, silmeler ve yanı sıra, bazı anti-mikrobiyal direnç oluşabilir çoklu gen kopya miktar protein tipi dahil olmak üzere, bir anti-mikrobiyal ilaç direnci, genetik çeşitlilik, analiz desen.
Introduction
Pyrosequencing "sentez ile dizileme" ilkesine dayanmaktadır nükleik asit dizisi için hızlı ve hassas bir yöntemdir. "Sentez ile sıralama" bir anda tamamlayıcı bükümünü sentezlemek için bir baz tek iplikli DNA şablon kullanılarak yapılan, ve içinde yer alan baz (A, T, G veya C), bir kemilüminesan tespit sinyali tarafından her adımında tespit içerir. Pyrosequencing Reaksiyon DNA şablonu, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polimeraz, ATP sulfurylase, lusiferin, lusiferaz ve apyrase içerir. Sentez Reaksiyon dört dNTP ve tek sarmallı biyotinlenmiş şablon DNA'ya DNA polimeraz birinin ilave edilmesi ile başlatılır. DNA polimeraz pirofosfat daha sonra tahliye edilmesini (Şekil 1) ile, şablon üzerine tamamlayıcı dNTP kapsar. ATP sulfurylase orantılı ATP'ye pirofosfat dönüştürür. ATP hangi oxyluciferin için luciferase lusiferaz-aracılı dönüşüm için bir katalizör olarak hareket ederışığı (Şekil 2) üretir. Işığın şiddeti dahil nükleotidlerin sayısı ile orantılıdır ve bir veya daha fazla dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP veya) ardışık olarak şablon bükümü (Şekil 3) mevcut olup olmadığını tespit eder. Herhangi bir tüzel kişiliği olmayan dNTP önce sentez reaksiyon devamı için bir sonraki dNTP ilavesi için apyrase tarafından düşer. Tek sarmal kollu DNA şablonundan DNA dizisini tespit edilene kadar bu "sentez ile sekanslama" tepki dört dNTP, her biri sıra ile tekrarlanır.
Pyrosequencing reaksiyon bir animasyon görmek için filmi görmek için buraya tıklayın .
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok yeni nesil dizileme yöntemleri ticari edilmiştir. En yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında üç Bu yöntemlerin her biri 3-11 sentez ile sekanslama bağlıdır. Iyon iletken dizi analizi, tek bir molekül gerçek zaman sıralaması ve sentezi (SBS) ile sıralama ama Incorporated nükleotid tespiti için yeni bir platform kullanır. Iyon yarı iletken sıralama içinde, tek bir DNA iplikçik sıralama iplikçik için bir şablon olarak hizmet vermektedir. 12 Polimeraz ve nükleotid sırayla pyrosequencing olarak eklenir. Bir nükleotid artan DNA sarmalı ilave edildiğinde, bir hidrojen iyonu serbest bırakılır. Hidrojen iyonu, bir saha etkili transistörün tabanlı sensör tarafından tespit edilir.
Tek bir molekül gerçek zamanlı sıralama sıfır modu dalga kılavuzu (ZMW) bağlıdır. 13 ZMW tek bir polimeraz molekül kuyunun dibinde bağlı küçük bir yapıdır. Bu, bir flore bir şekilde aydınlatılmışkoku molekülü tespit edilebilir. Her nükleotid bir floresan molekül ile etiketlenmiş. Bir floresan etiketli nükleotid dahil olarak, bir detektör nükleotid tanımlar. Aşağıdaki nükleotid eklendiğinde, floresan molekül yarılır. 14
Sentez ile Sequencing (SBS) eşsiz dizilerin kümeleri oluşturulan bu hedef DNA, yükseltmek için benzersiz bir yöntem kullanır. 15 tek sarmallı şablon oluşturulur ve daha sonra tamamlayıcı şeride sentezlenir. Her bir nükleotid, bir flüoresan molekül ile etiketlenir ve her bir baz ilave edildikten sonra ilave edilen baz floresan kaydedilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Johns Hopkins Üniversitesi, Ağ Geçidi Bilim Girişimi ve Qiagen A.Ş. aracılığıyla Provost Ofisi kısmen destek oldu
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| PyroMark PCR Master Mix, 2x | Qiagen | 978703 | |
| CoralLoad Concentrate, 10x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| Q-Solution, 5x | Qiagen | 978703, 978705 | |
| MgCl2, 25 mM | Qiagen | 978703, 978705 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| Primers | Qiagen | 978776 or 978777 | Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM. |
| Pyromark Gold Q24 Reagents | Qiagen | 970802 | |
| High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent) | |||
| Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-07 | |
| PyroMark Annealing Buffer | Qiagen | 979009 | |
| PyroMark Denaturation Solution | Qiagen | 979007 | |
| PyroMark Wash Buffer | Qiagen | 979008 | |
| PyroMark Q24 | Qiagen | 9001514 | |
| PyroMark Q24 Cartridge | Qiagen | 979202 | |
| PyroMark Q96 HS Tip Holder Box | Qiagen | 979105 | |
| PyroMark Q24 Vacuum Workstation | Qiagen | 9001516 | |
| PyroMark Q24 Plate Holder | Qiagen | 9022273 | |
| Orbital shaker | Fisher | 11-675-297 | |
| Heat block | Fisher | 11-718Q |
References
- . . PyroMark PCR Handbook. , (2009).
- . . PyroMark Q24 User Manual. , (2012).
- Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
- Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
- Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
- Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).
- Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
- J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
- Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
- Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
- King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
- Rothberg, J. W., Heinz, , et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
- Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
- Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
