JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Pyrosequencing לזיהוי ואפיון חיידקים

Published: August 22, 2013
doi:
10.3791/50405
, , , , ,
1Center for Biotechnology Education, Krieger School of Arts and Sciences,Johns Hopkins University, 2Qiagen Sciences, Inc.

Summary

Pyrosequencing הוא טכניקה תכליתית המאפשרת רצף הגנום של חיידקים שיכולים לשמש לזיהוי מיני חיידקים, להפלות זני חיידקים, וכדי לזהות מוטציות גנטיות המעניקות עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאלי. בסרטון הזה, ההליך לייצור חיידקי amplicon, pyrosequencing amplicon, וניתוח רצף ה-DNA יהיה הפגין.

Abstract

Pyrosequencing הוא טכניקה תכליתית המאפשרת רצף הגנום של חיידקים שיכולים לשמש לזיהוי מיני חיידקים, להפלות זני חיידקים ולזהות מוטציות גנטיות המעניקות עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאלי. היתרונות של pyrosequencing עבור יישומי מיקרוביולוגיה כוללים הקרנת תפוקה גבוהה מהירה ואמינה וזיהוי מדויק של חיידקים ומוטציות הגנום של חיידקים. Pyrosequencing כרוך רצף של ה-DNA על ידי סינתזה הגדיל המשלים בסיס אחד בכל פעם, תוך קביעת ההוויה של נוקלאוטיד הספציפי שהוכללה בתגובת הסינתזה. התגובה מתרחשת ב-DNA שבו ארבעה deoxyribonucleotides (dNTP) מתווספים ברצף ואת dNTPs מאוגדים הוא enzymatically מושפל לפני תוספת של dNTP הבא לתגובת סינתזת תבנית גדילים הבודד משותק. זיהוי של הבסיס הספציפי שולב בתבנית מנוטר על ידי דור של chemilumאותות inescent. סדר dNTPs המייצרים את אותות chemiluminescent קובע את רצף ה-DNA של התבנית. יכולת רצף זמן אמת של טכנולוגית pyrosequencing מאפשרת זיהוי חיידקים מהיר בassay אחד. בנוסף, מכשיר pyrosequencing, יכול לנתח את הגיוון הגנטי המלא של עמידות לתרופות אנטי מיקרוביאליים, לרבות הקלדה של SNPs, מוטציות נקודתיות, הוספות ומחיקות, כמו גם כימות עותקי גן מרובים שעלולים להתרחש בהתנגדות מסוימת אנטי מיקרוביאליים דפוסים.

Introduction

Pyrosequencing הוא שיטה מהירה ומדויקת לרצף חומצות גרעין המבוססת על העיקרון של "רצף בסינתזה". "סידור בסינתזה" כרוך בשימוש בתבנית ה-DNA גדיל בודדת לסנתז בסיס אחד הגדיל המשלים בכל פעם, וגילוי הבסיס המשולב (A, T, G, או C) בכל שלב על ידי זיהוי של אות chemiluminescent. תגובת pyrosequencing כוללת תבנית ה-DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), פולימראז ה-DNA, ה-ATP sulfurylase, luciferin, לוציפראז, וapyrase. תגובת הסינתזה היא שיזמה תוספת של אחד מארבעת dNTPs ופולימראז ה-DNA ל-DNA תבנית biotinylated גדילים הבודד. פולימראז ה-DNA משלב dNTP משלים על גבי תבנית, עם שחרורו הבא של pyrophosphate (איור 1). ה-ATP sulfurylase היחסי ממיר pyrophosphate ל-ATP. ATP משמש כזרז להמרת לוציפראז בתיווך של luciferin לoxyluciferin, אשריוצר אור (איור 2). עוצמת האור היא פרופורציונלית למספר המשולבים של נוקלאוטידים וקובעת אם של dNTP הספציפי אחד או יותר (dATP, dTTP, dGTP, או dCTP) נמצא על גדיל התבנית ברצף (איור 3). כל dNTP מאוגד הוא מושפל על ידי apyrase לפני תוספת של dNTP הבא להמשך תגובת הסינתזה. תגובה זו "רצף בסינתזה" חוזרת על עצמו עם תוספת של כל אחד מארבעת עד dNTPs רצף ה-DNA של תבנית ה-DNA גדילים הבודד נקבע.

לצפייה באנימציה של תגובת pyrosequencing לחץ כאן לצפייה בסרט.

Protocol

מבוא: מושבה חיידקים בודדת צריכה לשמש כדי לחסן מרק התרבות מתאים, המודגרות לילה. גלולה חיידקי מעובד מכן לטהר את הדנ"א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הגנומי זמינה מסחרי. הדנ"א הגנומי מטוהר צריך להיות 260/280 (ננומטר) יחס> 1.8 להבטיח כי המדגם הוא ללא זיהום חלבון. כמות ה-DNA גנומי הנדרש לדור של תבנית pyrosequencing היא 10-20 ng. ההגברה א 'של התבנית (PCR PyroMark Handbook; www.qiagen.com / ספרי הדרכה 1) הגדרת תגובת PCR הערה: פריימר אחד חייב להיות biotinylated בקצה 5 שלה ', וזה המליץ ​​לו להיות HPLC מטוהר להכנת תבנית. אנו ממליצים PyroMark Assay עיצוב תוכנת 2.0 לPCR וseעיצוב פריימר הגנום שמותאמים לרצפים קצרים לקרוא, לעומת זאת, פריימר-תפציץ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) מצמח השדה יכול גם לשמש לעיצוב פריימר. הפשירי את כל פתרונות הנדרשים (המופיע בטבלה 1) ומערבבים ביסודיות כל אחד. להגדיר את התגובה לפי טבלת 1. כל העבודה ניתן לעשות בטמפרטורת חדר. הערה: מיקס מאסטר PCR מכיל MgCl 2 לריכוז סופי של 1.5 מ"מ, המספק תוצאות משביעות רצון ברוב המקרים. אם נדרש + ריכוז גבוה Mg 2, μl עד 3.5 של 25 מ"מ MgCl 2 ניתן להוסיף תגובה. לערבב היטב את תערובת התגובה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה, ואז לוותר על כמויות מתאימות לתוך צינורות PCR. הוסף templatה-DNA דואר לכל צינור PCR. אנו ממליצים 10 ng של הדנ"א הגנומי. לתכנת את Cycler התרמית לפי טבלה 2. אחיזה סופית ב 4 ° C מומלץ לנוחות. אם אתם משתמשים בCycler תרמית ללא מכסה מחומם, תגובות שכבה עם 100 שמן מינרלי μl. מניחים את צינורות PCR בCycler ולהפעיל את תכנית רכיבה על אופניים. ב 'אבק Workstation פרוטוקול לשתק את מוצרי ה-PCR biotinylated הפוך את תערובת אמן על פי איור 4. הערה: לפני pipetting, בעדינות לנער את הבקבוק של חרוזים Sepharose streptavidin מצופים כדי להבטיח השעיה הומוגנית. בהתאם לכמות של המוצר ה-PCR בשימוש, לוותר 60-75 תערובת אמן μl לבאר כל צלחת PCR לתת נפח כולל של 80 μl בכל טוב. הוסף 5-20 מוצר PCR biotinylated μl היטב כל אחד. לאטום את הבארות עם הרצועה caנ.ב. ולהתסיס את צלחת ה-PCR ב1,400 סל"ד למשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר (15-25 ° C) באמצעות ייקר מסלולית. Denaturation של ה-DNA ותוספת של רצף פריימר לדלל את פריימרים רצף עד 0.3 מיקרומטר עם חישול חיץ ולוותר על 25 μl לבאר כל צלחת תגובה. מקם את הצלחת על תחנת העבודה. מלא את שקתות תחנת העבודה על פי תרשים איור 5. הפעל את משאבת הוואקום, וודא שהמתג על כלי הוואקום מוגדר ב( איור 6). לשטוף את בדיקות סינון מים עם טוהר גבוה (מילי-Q 18.2 ס"מ X MW או שווה ערך) בשוקת 5 (איור 5). למלא את השוקת במי טוהר גבוה טריים לשימוש בשלב 12. עבודה במהירות, למקם את צלחת PCR עם חרוזים על תחנת העבודה. ודא ששתי הצלחות הן באותו הכיוון כמו בעת הדגימות הועמסו. עם בורר ואקום ON, להנמיך את הוואקוםכלי לתוך הבארות של צלחת PCR עבור 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated. את החרוזים יהיו שנתפס על ידי כלי הוואקום (איור 7). עם הוואקום עדיין, שטוף את הכלי עם אתנול 70% (שוקת 1) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated. עם ואקום ON, לשטוף את הכלי עם פתרון denaturation (שוקת 2) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated. הערה: פתרון Denaturation מכיל סודיום הידרוקסיד, שהוא העין וגירוי עור. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, ומשקפי מגן. עם ואקום ON, לשטוף כלים עם חיץ לשטוף (שוקת 3) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated. עם ואקום ON, להעלות את כלי הוואקום למעבר ל -90 מעלות אנכיים למשך 5 שניות, כדי לאפשר את כל הנוזל לניקוז מחוץ לכלי הריק. הפעל את משאבת כיבוי, וליישר את כלי הוואקום עם צלחת התגובה. מנמיכים את הכלי לתוך הוואקוםבארות ובעדינות לנער מצד לצד כדי לשחרר את החרוזים לפריימר הרצף המכיל הבארות. על מנת לנקות את כלי הוואקום, להתסיס את בדיקות סינון מים בטוהר גבוה (שוקת 4) עבור 10 שניות. לעבור על הוואקום ולשטוף את הכלי עם מים טוהר גבוה (שוקת 5) במשך 20 שניות או עד שכל הנפח כבר aspirated. הרם את כלי הוואקום למעבר 90 מעלות צלזיוס אנכית למשך 5 שניות, ולאחר מכן לעבור את ואקום OFF ולאחסן במצב "חניה". חישול פריימר רצף לגדילי דנ"א מניחים את הצלחת בתגובת בעל צלחת מחוממת מראש. מחממים את הצלחת על בלוק חימום על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הסר את הצלחת מהמחזיק והמקום על השיש להתקרר בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. מבצע Q24 Pyromark הערה: הפעל את המכשיר באמצעות מתג ההפעלה ממוקמת מעל כבל החשמל. כוכבאיל יכול לקחת עד דקות 1. מלא מחסנית על פי ההוראות הניתנות בPyroMark זהב Q24 ריאגנטים Handbook 2. כדי לקבוע כמויות הדרושות, להגדיר קובץ להפעיל את התוכנה במכשיר, ותחת תפריט כלים בחר מידע הפעלה קדם אם המכשיר היה כבר ב, ודא שהוא אינו מבצע ריצה ולאחר מכן פתח את המכסה. אות אזהרה נשמעת תהיה נפלטת אם המכסה נפתח כאשר הוא אינו בטוח בכך. לפתוח את השער ולהכניס את מחסנית דיו עם התווית פונה קדימה (איור 8). ודא שהמחסנית הוכנסה כראוי (קו צריך להיות גלוי בחזית) וסוגר את השער. פתח את מסגרת צלחת האחזקה ולמקם את הצלחת עם דגימות בתוך המכשיר. סגור את מסגרת צלחת האחזקה ומכסה המכשיר (איור 9). החל לרוץ הכנס את מקל USB עם קובץ הריצהים שנוצר עם תוכנת המכשיר ליציאת ה-USB בחלק הקדמי של המכשיר. בחר באפשרות "הפעלה" בתפריט הראשי ולחץ על "אישור". השתמש בחיצי הגלילה כדי לבחור את הקובץ הרצוי ולחץ על הריצה "בחר". הערה: המכשיר יתחיל מחלק חומרים כימיים כאשר כל הלחץ שנקבע מראש ורמות הטמפרטורה הם הגיעו (זה עלול לקחת כמה דקות). במהלך ריצה, המכשיר מציג מסך pyrogram של נבחר היטב בזמן אמת. השתמש בחיצי הגלילה כדי להציג pyrogram של בארות אחרות. השלמת ריצה כאשר המכשיר מאשר שהוא סיים לרוץ ולרוץ הקובץ נשמר למקל USB, לחץ על "סגור". הסר את מקל USB. אם הוא הוסר לפני הריצה סיימה, הכנס את מקל USB. בחר באפשרות "מנהל" ולאחר מכן "פועל שלא נשמרו עותק". הקובץ לרוץ עכשיו ניתן לפתוח ונותח באמצעות תוכנת המכשיר והשוואהלספרייה של חיידקים ידועים באמצעות תוכנת Identifire.

Representative Results

את התוצאות של ריצת pyrosequencing טיפוסית באמצעות התוכנה מציגה את המיקום של primers קדימה הפוך משמש לייצור amplicon, ופריימר רצף משמש לתגובת pyrosequencing בתוך רצף ריבוזומלי 16S משומר (איור 10). רצף hypervariable בין פריימר אתרים מאפשר לזיהוי חיידקים של מספר גדול של מיני חיידקים באמצעות פריימר רצף המשומר (5'-TACATGCAAGTCGA). כבקרת איכות פנימית, סוגר רצף ה-DNA ניתן לבדוק את האזור משתנה כדי להבטיח שאזור ה-DNA הנכון כבר ניתחו . תוכנת pyrosequencing מאפשרת השוואה ויישור של רצף שנוצר למסד הנתונים של רצפים ריבוזומלי חיידקים לזיהוי חיידקים פנימיים. בנוסף, ניתן לנתח רצף כדי לקבוע מוטציות המקנים עמידים לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, ניתוח של מוטציות בגנים ריבוזומלי 23S של Helicobפילורי קבצים הבא מדגים שני דפוסי מוטציה (GAA או AGA) המקנים עמידים לאנטיביוטיקה (איור 11). ניתוח מבודד מרובים מאותה המטופל יכול להיות assayed במקביל למעקב אחר הופעתה של עמידות לתרופות לאורך זמן כדי לסייע בחקירות אפידמיולוגיים של התפרצויות סמים התנגדות חיידקים. איור 1. מוצר PCR biotinylated משמש כתבנית לשלב dNTPs ידי פולימראז ה-DNA, שהוביל לדור של pyrophosphate (PPI). איור 2. ה-ATP sulfurylase יחסי ממיר pyrophosphate לATP. מעשי ATP כזרז להמרת לוציפראז בתיווך של luciferin לoxyluciferin, שיוצרת אור שהוא פרו portional לסכום של ה-ATP. האור נרשם כשיא על עקבות pyrogram ומצביע על שילוב נוקלאוטיד. את dNTPs מאוגדים הם מושפל על ידי apyrase לפני dNTP הבא מתווסף להמשכו של הסינתזה. איור 3. עוצמת האור שנוצר מציינת אם של dNTP הספציפי אחד או יותר (dATP, dTTP, dGTP, או dCTP) התאגד על גדיל התבנית ברצף. איור 4. תרשים זרימה להכנת מיקס מאסטר כדי לשתק את המוצר ה-PCR biotinylated. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa ge = "תמיד"> איור 5. PyroMark תחנת עבודה, עם PCR צלחת, PyroMark צלחת, ובמקומות שוקת. איור 6. מיקומים של מתג אבק וכיבוי העמדות. איור 7. כלי ואקום. טיפול נכון של הכלי הריק. איור 8. מחסנית שער נפתח עם מחסנית במקום. איור 9. המחסנית הוכנסה כראוי עם השער סגור. "עבור: לשמור-together.within עמודים =" תמיד "> איור 10. Pyrosequencing תוצאות זיהוי חיידקים מבוססות. Primers PCR מיועד לאזורים נשמרים של תבנית ה-DNA, ופריימר רצף ממוקם מייד במעלה הזרם של רצף ה-DNA היטב מאופיין זיהוי hypervariable בתוך amplicon (מוצג בכחול). איור 11. זיהוי של עמידות לתרופות אנטיביוטיות בליקובקטר פילורי באמצעות pyrosequencing. ניתוח של מוטציות בגנים המקנים 23S התנגדות אנטיבקטריאלי בליקובקטר פילורי המכיל GAA או רצפי AGA. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <td> רכיב נפח לכל תגובה ריכוז סופי Pyro PCR מיקס מאסטר, 2x 12.5 μl 1x תתרכז CoralLoad, 10x 2.5 μl 1x 25 מ"מ MgCl 2 (אופציונלי) משתנה ≥ 1.5 מ"מ Q-פתרון, 5x (אופציונלי) 5 μl 1x פריימר / פריימר B משתנה / משתנה 0.2 מיקרומטר μM/0.2 מים RNase ללא משתנה – סה"כ נפח (לאחר הוספת התבנית ה-DNA) 25 μl טבלת מס '1. תערובת תגובת PCR. & Nbsp; הערות נוספות שלב הפעלה ראשוני PCR 15 דקות 95 מעלות צלזיוס פולימראז ה-DNA HotStartTaq מופעל רכיבה על אופניים שלב 3: Denaturation 30 שניות 94 מעלות צלזיוס רכוך 30 שניות 60 מעלות צלזיוס 56 מעלות צלזיוס להדנ"א הגנומי לדנ"א יומר bisulfite הארכה 30 שניות 72 מעלות צלזיוס מספר המחזורים 45 סיומת סופית 10 דקות 72 מעלות צלזיוס טבלת 2. מפרט מחזור PCR.

Discussion

מספר שיטות רצף של הדור הבא חדשות כבר ממוסחרים. שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר הם רצפי יונים מוליכים למחצה, רצף זמן אמת מולקולה בודד, ורצף בסינתזה (SBS). 3-11 כל אחת משיטות אלו תלויה ברצף בסינתזה אבל להעסיק פלטפורמות חדשניות לזיהוי של נוקלאוטידים Incorporated. ביונים מוליכים למחצה רצף, גדיל בודד של ה-DNA משמש כתבנית לגדיל רצף. פולימראז 12 ונוקלאוטידים מתווספים ברצף כמו בpyrosequencing. כאשר מתווסף לנוקלאוטיד גדיל DNA הולך וגדל, יון מימן הוא שוחרר. יון המימן הוא זוהה על ידי חיישן מבוסס טרנזיסטור אפקט שדה.

רצף זמן אמת יחיד מולקולה תלויה במדריך גל מצב אפס (ZMW). 13 ZMW הוא מבנה קטן שבו מולקולה אחת פולימראז מחוברת לתחתית הבאר. הוא מואר באופן כזה שפלורניתן לאתר מולקולת ריח. כל נוקלאוטיד מתויג עם מולקולת ניאון. כנוקלאוטיד מתויג fluorescently משולב, גלאי מזהה נוקלאוטיד. כאשר נוקלאוטיד הבא הוא הוסיף, מולקולת הניאון הוא ביקע. 14

רצף בסינתזה (SBS) משתמש בשיטה ייחודית כדי להגביר את ה-DNA היעד כך שהאשכולות של רצפים ייחודיים נוצרים. -15 תבניות התקועות יחיד נוצרים ולאחר מכן הגדיל המשלים הוא מסונתז. כל נוקלאוטיד מסומן עם מולקולת ניאון ולאחר כל הוספת בסיס הקרינה של הבסיס הוסיף נרשמת.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה היה תמיכה בחלקו על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, משרד למכללה דרך שער מדעי היוזמה וQiagen בע"מ

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
PyroMark PCR Master Mix, 2x Qiagen 978703
CoralLoad Concentrate, 10x Qiagen 978703, 978705
Q-Solution, 5x Qiagen 978703, 978705
MgCl2, 25 mM Qiagen 978703, 978705
RNase-Free Water Qiagen 129112
Primers Qiagen 978776 or 978777 Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM.
Pyromark Gold Q24 Reagents Qiagen 970802
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent)
Streptavidin Sepharose High Performance Beads GE Healthcare 17-5113-07
PyroMark Annealing Buffer Qiagen 979009
PyroMark Denaturation Solution Qiagen 979007
PyroMark Wash Buffer Qiagen 979008
PyroMark Q24 Qiagen 9001514
PyroMark Q24 Cartridge Qiagen 979202
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box Qiagen 979105
PyroMark Q24 Vacuum Workstation Qiagen 9001516
PyroMark Q24 Plate Holder Qiagen 9022273
Orbital shaker Fisher 11-675-297
Heat block Fisher 11-718Q
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. . . PyroMark PCR Handbook. , (2009).
  2. . . PyroMark Q24 User Manual. , (2012).
  3. Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
  4. Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).
  5. Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).
  6. Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).
  7. Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).
  8. J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
  9. Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
  10. Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
  11. King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
  12. Rothberg, J. W., Heinz, , et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
  13. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
  14. Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).

Tags

PyrosequencingMicrobial IdentificationMicrobial CharacterizationBacterial Species IdentificationBacterial Strain DiscriminationAntimicrobial Resistance DetectionHigh-throughput ScreeningMicrobial Genome SequencingSingle Base SequencingChemiluminescent DetectionReal-time SequencingSNP TypingMutation Detection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405, doi:10.3791/50405 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image