탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

1. 탯줄 혈액에서 Mononuclear 세포의 분리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 95 ML 린스 버퍼 (1시 20분 희석) 5 ML 소 혈청 알부민 (BSA) 재고 솔루션을 버퍼 추가 준비합니다. 가스를 제거하다 버퍼과 얼음의 버퍼를 유지 중요 :. 가스를 제거하다에 실패 CD19을 분리 할 때 버퍼가 최적의 결과보다이 발생할 수 있습니다 + 거품 절연 열을 차단할 수 있습니다 B-세포 때문입니다. 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 탯줄 혈액을 처리하는 데 필요한 튜브의 수 (1 관 8 ML의 피를 처리 할 수​​)를 결정하고 각 튜브에 Ficoll-Paque PLUS 15 ML를 추가합니다. 24 ML의 DPBS (1X)과 조심스럽게 층 50 ML 원뿔 튜브의 각 Ficoll-Paque PLUS 상단에 희석 코드 혈액 혼합물을 함께 탯줄 혈액 8 ML을 희석. 피와 Ficoll-Paque PLUS를 섞지 마십시오 중요 ​​:. 코드 혈액과 Ficoll-Paque PLUS의 혼합 방지하기 위해, 45도 각도로 관을 잡고레이어 혈액 혼합 천천히. 20 ° C.에 40 분 400 XG에 원심 분리기 Mononuclear 세포 (MNC)은에 유지됩니다 플라스마 Ficoll-Paque PLUS 인터페이스 Ficoll-Paque PLUS의 삼투압에 높은 밀도로 인해 침전 과립 성 백혈구와 적혈구 반면. 샘플 ID, 날짜 및 다음과 같은 제 3 부에 사용되는 라벨 칠 5 ML 내내 아래로 튜브 : 관 상표 목적 1 흠없는 유동 세포 계측법 동안 정상화를위한 흠없는 세포 이 7AAD 유동 세포 계측법 동안 생존을 확인하려면 3 + + + 정렬 될 셀을 포함 4 34 + CD34 + / CD19를 수집하려면 +(후반 프로-B – 초 전 BI) 세포 5 낮은 45 / CD19 낮은 + / CD45 (예정 BI) 세포 – CD34를 수집하려면 6 45 메드 / CD19 + / CD45 메드 (예정 BII) 세포 – CD34를 수집하려면 7 고 45 / CD19 + / CD45 고 (미숙 B) 세포 – CD34를 수집하려면 코트 튜브 4, 5, 6, 7 2퍼센트 FBS로하고 얼음에있는 모든 튜브를 놓습니다. 주의 깊게 상위 플라즈마 층을 기음과 mononuclear 세포 층과의 접촉을 피하십시오. 10 ML 유리 피펫 사용하여, 신중하게 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 mononuclear 세포 레이어를 전송할 수 있습니다. 하나의 50 ML 튜브에 함께 셋 튜브에서 mononuclear 세포를 결합합니다. PBS로 관을 채우기에서 10 분 300 XG에 부드럽게 혼합 원심 분리기20 ° C. 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 1X를 반복합니다. 첫 번째 세척 후 알약을 resuspend하고 단일 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 부드럽게 PBS 200 μl의 세포 펠렛을 resuspend. , 세포 현탁액 1 μl를 제거 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 PBS 1 ML에 추가하고 (원심 분리기에서 50 ML 세포 현탁액을 삽입 한 후 셀을 계산) 계산을 위해 따로 설정합니다. PBS로 관을 입력하고 혈소판을 제거하는 15 분을 위해 200 XG에 원심 분리기. 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서 완전히 표면에 뜨는을 제거합니다. 2. 맥 분리를 사용하여 Mononuclear 세포에서 수정 된 B-세포 절연 160 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼로 단계 1.7에서 펠렛을 Resuspend. 40 μl B-CLL 비오틴 항체 칵테일을 추가합니다. 4 ° C.에 잘 섞어 10 분에 품다하는 피펫 세포를 씻으 – 1 ML 감기 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼 만 10 당 세포 (세포 뉴 추가mber 단계 1.7)에 결정하고 10 분 300 XG에 원심 분리기. 완전히 표면에 뜨는을 대기음 후 320 μl 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼에있는 셀 펠렛을 resuspend. 80 μl 방지 비오틴 MicroBeads을 추가, 4 ° C.에 잘 섞어 15 분에 품다 세포를 씻으 – 1 ML 추위 10 분 300 XG에서 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼 만 10 당 세포와 원심 분리기를 추가합니다. 감기에 500 μl (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼으로 1 억 명의 셀 Resuspend. 휴대폰 번호에 따라 크기 버퍼 볼륨입니다. 원심 분리 (단계 2.5) 동안 맥 열 및 Mac 구분 기호를 준비합니다. 맥 구분의 자기장에 LS 열을 놓고, 차가운 3 ML (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼 열로를 추가하고 버퍼 칼럼을 통해 똑 할 수 있습니다. 를 통해 흐름을 잡아 소켓을 사용합니다. 을 통해 흐름을 폐기하십시오. 항목 아래의 50 ML 원뿔 튜브를 놓고 열에 세포 현탁액을 피펫. 라벨이없는 세포 통해서을 똑 할 수 있도록 허용H는 열 및 50 ML 원뿔 튜브에. 중요 :이 항체 라벨과 셀 정렬에 사용되는 셀입니다. 을 통해 흐름을 폐기하지 마십시오. 단계 2.5에서의 모든 셀을 복구하려면, 원추형 튜브의 벽에 추위 (4 ° C) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼의 추가 한 ML을 추가합니다. 부드럽게 섞어서 열에 남아있는 세포 현탁액을 피펫. 1X를 반복합니다. 열 통과 후 원뿔 튜브에 수집 된 라벨이없는 세포를 사용하여 2.8 단계로 진행합니다. 10 분 300 XG에서 PBS와 원심 분리기와 라벨이없는 세포를 포함하는 원뿔 튜브를 입력합니다. 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는을 제거합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 resuspend. 3. 셀 정렬에 대한 항체 라벨링 및 준비 (단계 1.4) "흠없는"이라는 튜브에 세포 현탁액 및 장소 1 μl를 대기음. 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼를 추가하고 얼음에 튜브를 저장합니다. 20 추가나머지 세포 현탁액에 백만 셀 당 각 항체의 μl (CD19, CD34 및 CD45). 잘 섞어서 RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 튜브를 놓습니다. 불이 해제와 함께 CD 항체 2-4 빛에 민감한, 완료 단계입니다. 항체와 부화의 30 분 후, 세포 현탁액의 40 μl를 기음과 "7AAD"이라는 튜브에 넣습니다. 2 분 500 XG에서 튜브와 원심 분리기로 1 ML PBS를 추가합니다. 표면에 뜨는를 제거하고 바인딩 버퍼 100 μl의 세포를 resuspend. 7AAD 7 μl (7 Aminoactinomycin D)를 추가하고 RT에서 10 분 동안 짙은 어둠 속 품다. 10 분 부화 단계를 완료 3.4 동안. CD 항체가 표시된 남아있는 세포를 포함하는 관의 상단에 PBS를 추가합니다. 3 분 500 XG에 튜브를 원심 분리기. 표면에 뜨는을 제거, 500 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼를 추가하고 셀 펠렛을 resuspend. "+ + +"이라는 튜브에 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송합니다. 세포 현탁액의 모든 복구하려면"+ + +"표시 관에 50 ML 원뿔 튜브 및 전송에 DD는 추가 한 ML EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) – PBS 버퍼. 부화 후 (단계 3.3), 7AAD 튜브에 300 μl 바인딩 버퍼를 추가 할 수 있습니다. "흠없는", "7AAD"와 "+ + +"샘플 "34 +", "45 낮은", "45 메드"와 "45 고"튜브는 유동 세포 계측법에 대한 준비가되어 있습니다. 4. MoFlo XDP 흐름 Cytometer를 사용하여 셀 정렬 정렬에 대한 설정 MoFlo는 : 레이저를 정렬, 비말 스트림을 안정화, 드롭 지연을 결정합니다. 제조업체의 지침에 따라 Invitrogen ABC 마우스 구슬 키트를 (또는 이와 유사한 것)를 사용하여 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 긍정적이든 부정적 인구의 최적 분리에 대한 형광 채널의 전압을 조정, 단일 색상 컨트롤을 실행합니다. 보상 계수를 설정하고 보상 매개 변수를 수집 프로토콜에를 적용 할 수 있습니다. 보상 계수에게 항체의 새 많은 취득 때마다 다시 설정합니다. 그림 2와 같이 플롯 등의 프로토콜을 만듭니다. , 흠없는 샘플을 실행 전압과 순방향 및 측면 분산을위한 게인을 설정하고 부정적인 형광 인구를 식별합니다. DNA 복구는 종류의 목표이기 때문에, 기준 액은 DNA 함유 파편 복구 샘플을 오염하지 않습니다 (≤ 1 %) 낮은 수 있도록 설정해야합니다. * 에어로졸 피난 시스템은 인간의 세포는 MoFlo에서 실행되는 생활을 항상 실행되고 있는지 확인합니다. 게이팅 전략 (그림 2)를 설정합니다 + + + 샘플 (~ 50,000 이벤트)의 작은 나누어지는을 실행합니다. B-세포 progenitors은 B-세포를 성숙에 동일하게 분산하지 않으므로, 림프구 게이트 잠재적 인 프로-B 세포를 포함하기 위해 SSC 대 FSC 계획에 + / CD34 + 인구 ungated CD19을 backgate. 이 샘플에서도 7AAD에 대한 부정적인 형광 인구를 설정합니다. 샘플 생존을 결정하는 7AAD 샘플을 실행합니다. 에서 높은 경쟁력있는 샘플에서 정렬 셀죽은 세포와 같은 초기은 (≥ 95 %) 무차별 착색하고 정렬 인구를 오염 할 수 있습니다. 네 인구를 수집하기 위해 정렬 결정을 설정 : CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 – / CD45 낮은, CD19 + / CD34 – / CD45 의대, 그리고 CD19 + / CD34 – 고 / CD45. 모든 인구의 정렬 결정에 림프구와 쌍으로 된 것 차별 게이트를 포함합니다. 정렬 팁에 나막신을 방지하기 위해 필터 + + 바로 정렬 및 집계는 정렬하는 동안 샘플에서 발생하는 경우 다시 필터 전에 40 μm 셀 스트레이너를 통해 + 샘플. 냉각 또는 얼음 포장 튜브 홀더에 PBS에서 2퍼센트 FBS으로 코팅 수집 튜브 (단계 1.4)으로 세포를 정렬합니다. 정렬이 완료 직후, DNA의 압축을 풉니 다.