从脐带血分离的前体B细胞亚群

1。脐血单个核细胞分离准备EDTA的PBS缓冲液中添加5毫升牛血清白蛋白（BSA）的储备溶液至95毫升漂洗缓冲液（1:20稀释）。德加的缓冲和保持缓冲区冰。 重要提示：未脱气缓冲隔离时，可能会导致在不到最佳的效果CD19 + B细胞，因为气泡会阻止隔离柱。 准备50毫升锥形管密度梯度离心法。确定所需的处理的脐带血管的数目（1管可以处理血8毫升），并在每个管中加入15毫升的Ficoll-Paque联合PLUS。 用24毫升的DPBS（1X），并仔细层稀释脐血混合物在每个50 ml锥形管的顶部，用Ficoll-Paque联合PLUS稀释8毫升脐带血。不要混合血液和帕克的Ficoll-PLUS。 重要提示：为了避免混合脐带血和帕克的Ficoll-PLUS，保持在45度角的管层的血液混合物缓慢。 在20℃下离心40分钟，在400×g离心单核细胞（MNC）将保持在等离子体的Ficoll-Paque联合PLUS接口，而粒细胞和红细胞的沉积物由于更高的密度的Ficoll-Paque PLUS的渗透压。出版商7 5 ml圆底使用的钢管，在与该样本ID，日期，和下面的第3部分： 管 标签 目的 1 未染色的未染色流式细胞仪检测细胞正常化 2 7AAD 要确定在流式细胞仪的可行性 3 + + + + 包含将被排序的细胞 4 34 + 为了收集CD34 + / CD19 +（晚B – 提前预BI）细胞 5 45 低 为了收集CD34 – / CD19 + / CD45 低 （BI）细胞 6 45 MED 为了收集CD34 – / CD19 + / CD45 MED细胞（前BII） 7 45 高 为了收集CD34 – / CD19 + / CD45 高 （未成熟的B细胞） 外套管4，5，6，和7与2％FBS和所有的管子放置在冰上。 吸上的等离子层，仔细，避免与单核细胞层接触。使用10毫升玻璃吸管小心转移到一个新的50毫升锥形管中的单核细胞层。的单核细胞从三个管结合成一个单一的50毫升的试管一起。 填充管，PBS，轻轻混匀，在300 XG离心10分钟，20°C。小心吸出上清液，不干扰细胞沉淀。重复1倍。在第一次洗涤后，悬浮颗粒，并转移到一个单一的50毫升锥形管。 轻轻重悬细胞沉淀，在200μl的PBS中。删除1微升的细胞悬液，加入1毫升的PBS在1.5 ml离心管中，并预留计数（计数细胞后，将50 ml细胞悬浮液在离心机中）。用PBS填充管，并在200×g离心15分钟以除去血小板离心。完全去除上清，不干扰细胞沉淀。 2。改进的B-细胞使用MACS分离的单个核细胞的分离从1.7步为160μl冷（4℃），EDTA-PBS缓冲液重悬沉淀。 加入40μlB-CLL生物素的抗体鸡尾酒。移液管拌匀，于4℃孵育10分钟洗涤细胞 – 加1毫升冷（4℃），EDTA-PBS缓冲液，每10万个单元格（单元格NU人數确定步骤1.7）中，并在300×g离心10分钟，离心。完全吸取上清，然后在320微升冷（4℃）EDTA的PBS缓冲液中重悬细胞沉淀。 加入80微升抗生物素微球，搅拌均匀，于4℃孵育15分钟洗涤细胞 – 添加1ml冷的（4℃）EDTA的PBS缓冲液，每10万个细胞，在300×g离心10分钟离心。在低温（4℃）EDTA-PBS缓冲液500μL重悬到100万个细胞。根据细胞数的比例缓冲液体积。 准备MACS柱和MACS分离器在离心过程中（步骤2.5）。一个LS柱放置在磁场的MACS分离器中，加入3毫升冷的（4℃）EDTA的PBS缓冲液中，在色谱柱上，并允许在缓冲区中的通过柱滴落。使用一个插座，以赶上流过。丢弃流过。 栏下方放置一个50毫升锥形管和移液到柱上的细胞悬浮液。允许未标记的细胞滴通过省h的色谱柱并进入50毫升锥形管。重要信息：这些将用于抗体标记的细胞分选的细胞。不要丢弃流过。为了恢复所有的细胞从步骤2.5，添加额外的1毫升的冷（4℃）EDTA的PBS缓冲液中的锥形管的壁。轻轻混匀列上移液剩余的细胞悬浮液。重复1倍。收集在锥形管中使用的标记的细胞通过柱后，继续到步骤2.8。 填充的锥形管，含有未标记细胞在300×g离心10分钟（用PBS）和离心机。小心地取出，而不会干扰细胞沉淀，取上清液。加入200μl的EDTA-PBS缓冲液中，并轻轻悬浮细胞。 3。抗体标记细胞分选和准备管标记为“未染色的”（步骤1.4）的细胞悬浮液，并放入吸液1微升。加入500μlEDTA的PBS缓冲液，并在冰上储存管。 加入20微升每种抗体（CD19，CD34和CD45）每百万个细胞的到其它细胞悬浮液。充分混匀，并放置在黑暗中30分钟，在RT管。 CD抗体是光敏感的，完整的步骤2-4关灯。 抗体孵育30分钟后，吸取40微升细胞悬浮液，并将其放置到管标记为“7AAD”。到管中并离心，在500×g离心2分钟，加入1毫升的PBS。除去上清液，加入100μl的结合缓冲液中重悬细胞。加入7微升7AAD（7 – 氨基放线菌素D），并在黑暗中孵育10分钟，在RT。在孵育10分钟完成步骤3.4。 加入PBS中含有剩余的细胞标记的抗体与CD的管的顶部。离心管中于500×g离心3分钟。除去上清液，加入500μlEDTA的PBS缓冲液中重悬细胞沉淀。的整个体积的细胞悬浮液转移到管中，标记为“+ + +”。要恢复所有的细胞悬浮液中西元一个额外1毫升EDTA-PBS缓冲液的50毫升锥形管和管转移到标有“+ + +”。 孵化后（步骤3.3），加入300μl结合缓冲液到7AAD管。 “不染”，“7AAD”和“+ + +”样本和“34 +”，“45低 ”，“45 MED”和“45 高 ”管准备流式细胞仪检测。 4。使用的MoFlo XDP流式细胞仪细胞分选 SET-UP MoFlo排序：对准激光器，稳定液滴流，确定截止延时。 准备根据制造商的说明使用Invitrogen ABC鼠标磁珠试剂盒（或类似）的单一色彩补偿控制。运行单一颜色控制，调整荧光通道的电压，以获得最佳分离阳性和阴性的人群。设置补偿系数，适用于收集协议的补偿参数。重新建立补偿系数每一次得到一个新的大量的抗体。 创建协议包括如在图2中示出的图。 运行未染色的样品，正向和侧向散射光的设置电压和增益，并确定负荧光人口。由于DNA恢复目标的排序，应设置阈值低（≤1％），因此，DNA的碎片不会污染回收的样本。 *确保在任何时候，生活被上运行的MoFlo的人体细胞的气溶胶疏散系统正在运行。 运行一个小的分量+ + +样品（约50,000个事件），设置的门控策略（ 图2）。由于B-细胞的祖细胞不分散等同于成熟的B细胞，背栅非门CD19 + / CD34 +人口，到SSC和FSC情节的，以确保淋巴细胞门，包括潜在的原B细胞。从这个示例还设置负的荧光人口为7AAD。 运行的7AAD的的样本，以确定样品的可行性。只有细胞的样品具有高生存能力的排序一开始（≥95％），死亡的细胞会弄脏不分青红皂白地和可能污染排序人群。 设置排序的决定，收集四个群体：CD19 + / CD34 +，CD19 + / CD34 – / CD45 低 ; CD19 + / CD34 – / CD45 MED和CD19 + / CD34 – / CD45 很高的 。包括在排序的决定的所有人群的的淋巴细胞和双峰歧视门。 在分拣小费为防止堵塞，过滤器+ + +示例通过40μm紧接排序和重新过滤，排序，如果没有聚合发生在样本期间之前的细胞过滤网。 分类的细胞到涂覆有2％FBS的在PBS中，在冷却的或冰的包装管夹持器的收集管（步骤1.4）。 排序后立即完成后，提取DNA。