Summary

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Published: May 16, 2013
doi:

Summary

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Abstract

Ganglion hücrelerinin retinanın çıkış nöronlar ve faaliyetlerini belirli sinir devrelerinden kaynaklanan birden fazla sinaptik girdi entegrasyonu yansıtır. Voltaj-kıskaç ve akım kelepçe yapılandırmalarda yama kıskaç teknikleri, yaygın olarak nöronların fizyolojik özelliklerini incelemek için ve sinaptik girişleri karakterize etmek için kullanılır. Bu tekniklerin uygulanması son derece bilgilendirici olmasına rağmen, onlar çeşitli sınırlamalar oluşturmaktadır. Örneğin, eksitatör ve inhibitör girdi kesin etkileşimleri tepki çıkışı nasıl etkilediğini ölçmek zordur. Bu sorunu gidermek için, biz de iletkenlik kelepçe 1, 2, 3 olarak adlandırılan değiştirilmiş bir akım kelepçe tekniği, dinamik kelepçe, kullanılan ve sinirsel uyarıların üzerinde eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi etkisini inceledi. Bu teknik, hücre içine akım enjeksiyon gerektirir ve o zaman onun membran potansiyelinin gerçek zamanlı geribildirim bağlıdır. Enjekted mevcut önceden belirlenmiş eksitatör ve inhibitör sinaptik iletkenlikleri, onların ters potansiyelleri ve hücrenin anlık membran potansiyeli hesaplanır. Deney prosedürleri ile ilgili ayrıntılar, dinamik sıkıştırma tekniğinin bir bütün hücre konfigürasyonu ve iş elde etmek için hücreleri sıkma yama Bu video makalede de gösterilmiştir. Burada, kumanda koşullarda ya da ilaç mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen çeşitli iletkenlik dalga fare retinal ganglion hücre sırasında olan tepkileri gösterir. Ayrıca, hücre yanıtları incelemektir alfa fonksiyonları kullanarak oluşturulan suni eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri kullanılmasını gösterir.

Introduction

Retina gözün arka astar yakın bir şeffaf sinir dokudur. Birçok çalışma, ilk görsel işleme adımları ve sinaptik sinyal mekanizmaları araştırmak için model olarak retina kullanın. Tüm montaj hazırlanmasında retina ağ diseksiyonu sonra bozulmadan kaldığı için, onun fizyolojik yanıtlar in vivo koşullarda çok benzer olarak sinaptik etkileşimleri çalışmak için ideal bir sistem temsil eder. Böylece, kendi nöronların özelliklerini yama kelepçe teknikleri (tekniği ile ilgili yorumlar için, 6,9,13 bakınız) kullanılarak incelenebilir izole bir retina kullanarak. Farmakolojik ajanlar çeşitli sitelerde hareket gibi özel devreler ve ganglion hücre yanıt nörotransmitterlerin tam katkısının belirlenmesi, ancak, genellikle engellenmektedir.

Işık retina nöronların fizyolojik yanıtlar, doğal uyarıcı, hücre içi sıvı dolu cam pipetler ile kaydedilebilir. Yama cl kullanarakamp teknikleri, ışık uyarılması nöronal yanıtları membran potansiyeli dalgalanmaları (Güncel kelepçe) veya akım (voltaj kelepçe) olarak kaydedilebilir. Farklı gerilimlerde membran potansiyeli tutarak ve sonradan iletkenlik analizi uygulayarak, bu inhibitör ve eksitatör sinaptik girdi 5,12 izole etmek mümkündür. Bu tür deneyler normal bir banyo ortamı içinde ve farklı nörotransmitter ve nöronal yanıtları reseptörlerinin katkı yalıtmak için farklı farmakolojik ajanların varlığında gerçekleştirilebilir. Birçok laboratuarlardan çalışmaların bir zenginlik spike çıktı ve uyarıcı boyut gibi özellikleri, kontrast, mekansal ve zamansal frekansları, yön, yönlendirme ve diğer uyarıcı değişkenlere eksitatör ve inhibitör girdi bağımlılığı karakterize. Bu deneysel yaklaşımlar başak çıkışı ve uyarıcı özellikleri bir fonksiyonu olarak sinaptik girişleri arasındaki ilişki hakkında bilgi vermek olsa da,hücre uyarılma özgü hücre tipleri ve sinaptik girdi katkısı yorumlanması kolay değildir. Bu, tipik olarak uyarıcı ve inhibitör girişi uyarıcı özelliklerine bağlı olarak değişir ve bu nedenle, bu girişlerin her biri değişiklikler nöronal spike üzerinde sahip olduğu kesin etkisini değerlendirmek mümkün değildir olmasından kaynaklanmaktadır.

Bu sınırlamalar aşmak için alternatif bir yaklaşım çıkış spike bireysel sinaptik girdi katkısı bir eleştirel değerlendirme izin dinamik kelepçe kayıtları üzerinden taşımaktır. Dinamik kelepçe tekniği hücreye akım direkt enjeksiyon sağlayan ve belirli bir zamanda mevcut enjekte miktarı o zaman 1,2,3 (inceleme için, 7,14 bakınız) kaydedilen membran potansiyeline bağlıdır. Bu modifiye edilmiş bir akım kelepçe set-up olduğu kayıt altında hücre ve özel donanıma oluşan donanım, yazılım arasında gerçek zamanlı, hızlı geri besleme etkileşimve bir bilgisayar elde edilir. Hücreye geçerli enjekte miktarı buna göre hesaplanır. Bu nedenle, bu yöntemin avantajı hücre iletkenlik dalga farklı kombinasyonları ile stimüle edilebilir, ve tepki sinaptik girdi aracılık reseptörlerinin aktivasyonu taklit edecek olmasıdır. Örneğin, küçük bir nokta için uyarıcı iletkenlik enjeksiyonu için tepki ile küçük bir nokta için eksitatör ve inhibitör iletkenlikleri enjeksiyonu yanıt karşılaştırılması sadece hücre yanıt inhibisyonu etkisi hakkında bilgi sağlar. Aynı şekilde, fizyolojik olarak kaydedilen iletkenlikleri diğer kombinasyonları başak çıkış nasıl etkilediğini uyarıcı bağımlı eksitatör ve / veya inhibitör iletkenlikleri değişiklikleri ortaya çıkarmak için birlikte enjekte edilebilir.

Bizim çalışmamızda, dinamik klemp tekniği nispi genlik ve retinal ganglion hücreleri ateşleme özelliklerine sinaptik girdi zamanlamasının etkisini göstermek için kullanılır. Çeşitli iletkenlikleriKontrol koşullarında ya da farmakolojik ajanların mevcudiyetinde fizyolojik deneylerden elde edilen girdi olarak kullanılmıştır. Buna ek olarak, alfa fonksiyonları dayalı yapay iletkenlikleri de sinaptik girişleri nöronlar tarafından entegre nasıl araştırmak amacıyla kullanılmıştır. Bu nedenle, bu iletkenlik çeşitli farmakolojik olarak veya hesaplama aynı ganglion hücre içine enjekte edilmesi, ya da fizyolojik olarak oluşturulur, bu uçlara tepkilerin nedenle karşılaştırma yapılabilir sağlayan çok yönlü bir tekniktir.

Protocol

1. Genel Kurma ve Doku Hazırlama 30 dakika (kendi stres düzeyini azaltmak amacı) için karanlıkta fare tutun. Beklerken, hücre dışı çözelti 1 L hazırlar. Üretim Milli-Q su içinde yarım litre sodyum bikarbonat ve 1.9 g çözülür. PH değeri% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklar ile 7.4 'de muhafaza edilmektedir. Beş dakika sonra, Milli-Q su ile 1 L'ye kadar iyi, sodyum bikarbonat çözeltisine ilave edildi, Milli-Q su içinde, 100 ml Ames Orta 8.8 g çözülür ve iyi…

Representative Results

Ganglion hücre yanıtları inhibitör girdi farklı kaynaklardan katkısı çeşitli iletkenlik dalga uygulaması ile gösterilmiştir. Bu dalga formları, normal koşullarda ve bloklar tesirinin inhibitör retina internöron bir alt potansiyel üretimi sağlar. Şekil 2A, enjeksiyon için temsili bir tepki gösterir TTX bir voltaj kapılı Na + kanal engelleyicisi varlığında, farklı parlaklık uyarıcı ile elde edilmiştir eksitatör ve inhibitör iletkenlik dalga normal şartlarda gri…

Discussion

Burada oranı ve uyarma ve retina ganglion hücre çıkış inhibe göreli zamanlama etkisini değerlendirmek için dinamik kelepçe kullanımını göstermektedir. Dinamik kelepçe yaşayan nöronların içine fizyolojik kaydedilmiş veya yapay sinaptik iletkenlikleri tanıtmak için bilgisayar simülasyonları kullanır. Bu metodoloji iletkenlikleri değiştirilmiş ve nöronal yanıtları üzerindeki etkilerini hesaplamak için nöronlar enjekte edilebilir hangi interaktif bir araçtır. İletkenlik dalga görsel uya…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Biyomedikal Bilim Disiplin gelen Avustralya Araştırma Konseyi (ARC DP0988227) ve Biyomedikal Bilim Araştırma Girişimi Grant, Sydney Üniversitesi tarafından desteklenmektedir. Ekipman Patch Kelepçe Amplifikatör EPC 8 Biyomedikal Bilim, Sydney Üniversitesi Disiplin gelen Başlangıç ​​Fonu tarafından finanse edildi. Ekipman InstruTECH LIH 8 +8 Veri Toplama Sistemi Rebecca L. Cooper Vakfı ve Biyomedikal Bilim, Sydney Üniversitesi Disiplin gelen Başlangıç ​​Fonu'ndan para ile satın alındı. Biz onların anlayışlı öneriler ve yorumlar için anonim teşekkür etmek istiyorum.

Materials

      Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic Pharmachem    
Ames Medium with L-Glutamate (Powder) Sigma-Aldrich    
Potassium Gluconate, Anhydrous Sigma-Aldrich    
HEPES Sodium salt Sigma-Aldrich    
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) Sigma-Aldrich    
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma-Aldrich    
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid Sigma-Aldrich    
Paraformaldehyde Powder, 95% Sigma-Aldrich    
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) Invitrogen    
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml Invitrogen    
Fluorescent Preserving Media BioFX Laboratories Inc.    
      Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) Warner Instruments 64-0794  
Single Stage Glass Microelectrode Puller Narishinge Japan Model PP-830  
Minipuls 2 Gilson    
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit Millipore Corporation SLGV004SL  
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G Smith & Nephew (Australia)    
Single Inline Solution Heater Warner Instruments Model SH-27B  
Dual Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-344B  
Olympus Stereomicroscope SZ61 Olympus Corporation    
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective Olympus Corporation    
0-30 V 2.5 A DC Power Supply Dick Smith Electronics Q1770  
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool Jenoptik    
Micromanipulator MP-225 Sutter Instrument Company    
Patch Clamp Amplifier EPC 8 HEKA Elektronik    
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System HEKA Elektronik    
Computer: DELL Dell Corporation    

References

  1. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
  2. Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
  3. Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
  4. Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
  5. Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
  6. Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
  7. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
  8. Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
  9. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  10. Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
  11. Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
  12. Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
  13. Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
  14. Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
  15. Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
  16. Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
  17. Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).

Play Video

Cite This Article
Huang, J. Y., Stiefel, K. M., Protti, D. A. Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (75), e50400, doi:10.3791/50400 (2013).

View Video