Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays
Summary
Mikroplatten-basierten Verfahren werden für die farbmetrische oder fluorimetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen die Schnelltest an einer solchen Tätigkeit in großer Zahl von Umweltproben in einem überschaubaren Zeitrahmen.
Abstract
Ein Großteil der Nährstoffkreislauf-und Kohlenstoffverarbeitung in natürlichen Umgebungen erfolgt durch die Aktivität extrazellulärer Enzyme, die von Mikroorganismen freigesetzt. So kann die Messung der Aktivität der extrazellulären Enzyme Einblicke in den Sätzen der Ökosystemebene Prozesse, wie den Abbau organischer Materie oder Stickstoff-und Phosphor-Mineralisierung geben. Assays der extrazellulären Enzymaktivität in Umweltproben beinhalten typischerweise das Aussetzen der Proben gegenüber künstlicher kolorimetrische oder fluorometrische Verfolgung Substrate und die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse. Hier beschreiben wir auf Mikrotiterplatte Methoden für diese Verfahren, die die Analyse einer großen Anzahl von Proben innerhalb eines kurzen Zeitrahmens zu ermöglichen. Die Proben dürfen mit künstlichen Substraten innerhalb von 96-Well-Mikroplatten oder tiefe Well-Mikroblöcke reagieren, und die Enzymaktivität wird anschließend durch Absorption oder Fluoreszenz der resultierende Endprodukt unter Verwendung eines typischen Mikro reade bestimmtr oder Fluorometer. Solche hohen Durchsatzverfahren erleichtern nicht nur Vergleiche zwischen den räumlich getrennten Stellen oder Ökosysteme, sondern auch die Kosten für solche Tests wesentlich zu reduzieren, indem Gesamtreagenzienvolumina pro Probe benötigt.
Introduction
Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu erhalten Nährstoffe und Kohlenstoff von komplexen organischen Verbindungen, durch die Produktion von extrazellulären Enzymen. Diese Enzyme hydrolysieren typischerweise Polymere in kleinere Untereinheiten, die in die Zelle aufgenommen werden können. Daher wird bei einer ökologischen Ebene sind diese mikrobiellen extrazelluläre Enzyme, die für einen Großteil der Nährstoffmineralisierung und den Abbau organischer Materie, die in natürlichen Umgebungen auftritt verantwortlich. Enzyme wie Cellobiohydrolase (CBH) und β-Glucosidase sind für Celluloseabbau und arbeiten gemeinsam, um die Hydrolyse von Cellulose zu Glucose 1,2, das eine verwertbare Kohlenstoffsubstrat zur Aufnahme und mikrobielle Assimilierung bietet katalysieren. Das Enzym Phosphatase Mitteilungen löslichen anorganischen Phosphatgruppen von Organophosphaten wesentlichen Mineralisierung Phosphat und macht es für die Verwendung durch die meisten Organismen 3 verfügbar. Andere Enzyme, wie N-Acetylglucosaminidase (NAGase), sind important in Chitin-Abbau und kann sowohl Kohlenstoff und Stickstoff für die mikrobielle Erwerb 4 verfügbar zu machen.
Eines der Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen extrazelluläre Enzymaktivität in natürlichen Umgebungen ist die Verwendung von künstlichen p-Nitrophenyl (p NP) verbunden Substrate, ein Ansatz, der ursprünglich entwickelt wurde, um Boden-5-Phosphatase-Aktivität zu erkennen. Dieser Ansatz beruht auf dem Nachweis einer farbigen Endprodukt, p-Nitrophenol, die freigesetzt wird, wenn das künstliche Substrat durch das geeignete Enzym hydrolysiert. Das p-Nitrophenol kann anschließend kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei etwa 400-410 nm quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist seit angewandt, um andere Enzyme, wie NAGase 6 zu erfassen, und wurde in verschiedenen Studien verwendet worden betrachten mikrobielle extrazelluläre Enzymaktivität in Böden und Sedimenten 7-9.
Ein alternativer Ansatz, die originall wary entwickelt, um extrazelluläre Glucosidase-Aktivität zu beurteilen in Gewässern 10,11 macht Gebrauch von 4-Methylumbelliferon (MUB) verbunden Substraten. Das Endprodukt freigesetzt (4-Methylumbelliferon) ist stark fluoreszierend und können mit einem Fluorometer bei einer Anregungs / Emissionseinstellung um 360/460 nm detektiert werden. Eine Vielzahl von MUB vernetzt künstlichen Substrate zur Verfügung stehen, wodurch die fluorometrische Messung der Aktivität mindestens so viele Enzyme (z. B. β-Glucosidase, Cellobiohydrolase, Nagase Phosphatase) wie mit dem p-Substrat NP kolorimetrischen Verfahren analysiert werden. Andere mikrobielle extrazelluläre Enzyme, wie das Protein abbau Leucin-Aminopeptidase kann fluorometrisch unter Verwendung von 7-Amino-4-methyl (COU) verbunden Substrate getestet werden. Sowohl MUB-und COU-verknüpften Substraten wurden verwendet, um die Enzymaktivität in verschiedenen terrestrischen und aquatischen 12,13 Proben zu bestimmen.
Während frühere Studien haben described fluorometrischer oder farbmetrischen Mikro Ansätze zur extrazellulären Enzymaktivität 14 zu bestimmen, es gibt eine Notwendigkeit für eine klare Darstellung, wie solche Tests durchzuführen. Hier zeigen wir, Verfahren für eine Hochdurchsatz-Mikrotechniken für die Analyse von extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten unter Verwendung des kolorimetrischen p-NP verbunden Substrate Ansatz und in natürlichen Gewässern mit Hilfe der Fluoreszenz MUB-verknüpfte Substrate Technik. Wir konzentrieren uns auf die Messung der Aktivitäten der β-Glucosidase, NAGase und Phosphatase als diese Enzyme an Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Radfahren gebunden sind. Jedoch können die hier beschriebenen Verfahren auf die Messung anderer extrazellulärer Enzyme mit verschiedenen künstlichen Substrate aufgebracht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bestimmung der Aktivität einer Vielzahl von mikrobiellen extrazelluläre Enzyme in Böden und Sedimenten können nützliche Einblicke in Raten von Nährstoffmineralisierung und organische Stoffe Verarbeitung 17 vorzusehen. Allerdings können Böden in ihren Feuchtigkeitsgehalt variieren, so ist es wichtig, den Boden Trockengewicht standardisieren Aktivität. Dies erfordert einen zusätzlichen Trocknungsschritt (typischerweise von zwei Tagen), über die einfache Messung der Enzymaktivität. Somit im Gegen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung für Aspekte dieser Arbeit wurde von verschiedenen Quellen, einschließlich des United States Department of Agriculture Spezifische Kooperationsvertrag 58-6408-1-595 und der National Science Foundation (preis 1049911) zur Verfügung gestellt.
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
References
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