蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em>その場で</emで>ハイブリダイゼーション<em>サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

図1および図2は、FISHの実験手順とFISH像を定量化するために用いられる画像解析パイプラインの概略図である。 1。準備するためのソリューション以下*ソリューションは歌手プローブで使用するためのものです。ステラリスプローブを使用する場合、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄バッファーの両方で、 "10％ホルムアミド"と "40％ホルムアミド"を交換してください。ステラリスプローブを用いたハイブリダイゼーションバッファーに追加の変更（1）1グラムデキストラン硫酸を追加している、（2）10mgを一本鎖DNAを含んでいません。 バッファーB 8ミリリットル1 M KH 2 PO 4 41.5ミリリットル1M K 2 HPO 4 ソルビトール109.3グラム Spheroplastingバッファ 890μlのBuffer B 100μlのVRC 10μlの25,000 U / mlのリチカーゼ 2μlのβ-メルカプトエタノール <strong>のハイブリダイゼーション緩衝液（10ミリリットル、最終容量） 10 mgのE.大腸菌のtRNA 10mgを一本鎖DNA * 100μlの200mMのVRCの株式 50 mg / mlのBSA40μlの 1ミリリットル20X SSC 4ミリリットル40％ホルムアミド* ヌクレアーゼフリー水（10mlの最終体積まで） 1グラムデキストラン硫酸* *ハイブリダイゼーション緩衝液は、便宜上-20℃で0.5ミリリットルのアリコートに維持することができる。 （50ミリリットル、最終容量）バッファを洗う 5ミリリットル20X SSC 20ミリリットル40％ホルムアミド* ヌクレアーゼフリー水（50mL最終容量） ラベルバッファ 1.06グラムの炭酸ナトリウム 100ミリリットルDEPC水 pHが9 2。プローブ標識（歌手プローブのみ） 私たちは、ABIのオリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内の合成によってこれらのプローブを得る。 Typic同盟国は、4-5〜50塩基対のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも10 8、+ BP離隔いくつチミジン用アミノアリルチミジンを代入し、目的の遺伝子と相同であることを合成される。 CY染料を使用している場合があるためオゾンに対する感受性のため、私たちは、オゾンフリーの施設で働いています。 〜5プローブを取得し、100μlの水に懸濁し – ナノドロップのチェック濃度。 どのように多くのプローブ/遺伝子に応じて、10μgのオリゴヌクレオチド/遺伝子（ 例えば 5プローブ/遺伝子を持っている場合は、2μgの/プローブしたい）との合計配合しています。 QIAクイックヌクレオチド除去キットプロトコルに従ってプローブを精製するQIAクイック列を使用します。 複合プローブとミックスの総容積に10倍量のバッファーPNを追加します。 QIAクイックカラムにサンプルを適用 – 総容積は、2回のスピンでボリュームの半分を使用してスピンダウンし、750μlのよりも大きい場合 1分間放置。 6,000 rpmで1分間遠心します。 750μlのBuffer PEで洗浄。 遠心6,000 rpmで1分。 乾燥するために13,000 rpmで1分間フロースルーと再スピンカラムを廃棄してください。 H 2 OのpHは7.0〜8.5の範囲内であると、膜上に直接配置されていることを確認します-新しいマイクロチューブ及び50μlのH 2 Oで溶出したDNAに置きQIAクイック列。 1分間放置。 DNAを溶出するために13,000 rpmで1分間遠心します。 45℃でDNAを凍結乾燥 10μlのラベルバッファ内のペレットを再懸濁しと染料に触れることなく、染料のチューブに加える。 別の10μlのラベルバッファーで繰り返します。 ボルテックスと色素とDNAのチューブをスピンダウン。 アルミホイルでチューブをカバーし、ラベルにRT O / N暗所で保管してください。 QIAクイックヌクレオチド除去キットプロトコルを繰り返します。 2つの違いを実行します。 – プローブに200μlのPNバッファを追加して、2倍のカラムを通して標識プローブを置く。 – 溶出前にアタッチされていない染料を洗い流すために、バッファPEで3回洗浄を行います。 AFター溶出光度計を経由して濃度を得る。標識効率は、典型的には一本鎖DNAの約0.25ピコモル/ NGである。 3。カバースリップの準備プラズマpreen、修復真空室（内スライドの上に置いてカバースリップhttp://www.plasmapreen.com/ ）（良い中心に近い）。 電子レンジで真空チャンバーを入れて、それが密閉されていることを確認します。 ポンプの電源をオンには、まず、ポンプが起動され、一度だけ真空をオンにします。 電子レンジの電源をオンにして、プラズマが表示されている後5秒停止。 その後、ポンプを真空の電源をオフにします。 真空チャンバーを引き出し、鉗子（再び洗浄する必要が下落しているもの）でカバースリップを削除します。 場所カバースリップは、12ウェルプレートで側をクリーンアップ。 4。固定手順最少培地に0.1〜0.2程度のOD 600に酵母を育てる。細胞の10mlを十分にFOを生成R〜10別ハイブリダイゼーション。 増殖培地（培養10mlの+ 1ミリリットル37％ホルムアルデヒド）に直接1/10の容積37％ホルムアルデヒドを追加し、45分間放置します。 マイクロ遠心チューブ（1分間13,000 rpmで回転することができます）で、1mlの氷冷緩衝液Bで2倍洗う。 spheroplasting緩衝液1mlを加える。 15分間37℃でインキュベートする。ほとんどの細胞（ すなわち位相明るくない）黒になるまで細胞を顕微鏡下で数分ごとにチェックしてください。 低速（〜3,500 rpm）で回転し、氷冷緩衝液Bで2倍洗う。 、70％エタノール1 mlを加え穏やかに再懸濁します（-20℃で無期限に保存することができます）4℃で一晩おきます。 5。ハイブリダイゼーションの手順ハイブリダイゼーション溶液を準備します。ハイブリダイゼーション緩衝液を100μlに、プローブの1-3μlを添加し、その後ボルテックスと遠心。歌手プローブはプローブセット当たり8-10 ngの合計（ つまり当たり遺伝子）を使用します。我々は3 DIFと同時に3遺伝子にまでイメージしていますferent標識プローブセット。 それを開く前に室温にハイブリダイゼーション溶液を温めるようにしてください。 ステラリスプローブの場合、それは1が最適であるかを確認するためのプローブの希釈作業1:10 1:20 1:50 1:1001μlのそれぞれを追加することで、4つの別々のハイブリダイゼーション反応を開始することをお勧めします。ステラプローブの作業希釈物をハイブリダイゼーション緩衝液中で調製される。 遠心分離機（後続のすべてのステップのために、3,500 rpmで、5分）で固定した細胞（ 例えば 200μl）を、エタノールを取り除く吸引。 穏やかにハイブリダイゼーション緩衝液と同じ割合ホルムアミドを含有する、1mlの洗浄緩衝液中で再懸濁する。 2-5分間放置。 サンプルを遠心分離し、洗浄緩衝液を吸引し、ハイブリダイゼーション溶液を追加します。穏やかに振盪し、37℃でO / N°Cで、暗所でインキュベート注：次の手順では、カバーガラス上の細胞を適用/イメージングのためのものです。のw代替の活性酸素種のスカベンジャー溶液が見含む96ウェルプレートに細胞をアッシング/イメージングhttp://www.biosearchtech.com/stellarisprotocolsた。 翌日、 又は予め 、クリーン（手順を参照）と5分間、150μlの0.01％ポリ-L-リシンでカバースリップを扱う。吸引、のdH 2 Oで3回洗浄し、乾燥させ、乾燥させます。 午前中は、サンプルに洗浄緩衝液1mlを加え軽く懸濁し、遠心分離や吸引、その後30分間37℃で洗浄バッファーとインキュベートの別1mlに再懸濁します。 シェーカー上でRT 15分で2X SSC + 0.1％トリトンX-100で洗浄する。 それをマウントする前にRTに考え出すことができるように冷凍庫の封入剤を取り出します。 シェーカー上でRT 15分で1X SSCで洗浄する。 150μlのPBSにDAPI（最終は0.1μg/ ml）を再懸濁し、細胞を希釈する。 洗浄/ポリのLys-トリートメントルーム、ドラッグプレースソリューション12ウェルプレートでのテッドカバースリップ、邪魔されずに少なくとも30分間。 溶液を除去します（バックアップとして予備のカバースリップの上に置くことがあります）し、1ml 1X PBSで3回洗浄する。 スライド上にゴールドマウンティング培地を延長の代わりに3液（インビトロジェンP36934）。あなたはメディアをマウントするの乾燥を避けるため、複数のカバースリップを持っている場合に、随時、このいずれかを実行します。 ピンセットで保持しながら、12ウェルプレートにカバースリップに〜0.5ミリリットルのエタノールを加え、乾燥したカバースリップと空気を除去する。 メディアをマウントするにスリップ細胞側を下にカバーし、暗闇の中で硬化する数時間またはO / Nを聞かせて置きます。 マニキュアとの縁をシールし、イメージングに進みます。 6。オリンパスIX-81倒立顕微鏡の概要を有する細胞のイメージング画像取得のために我々はSlidebook（インテリジェントimaging.com）ソフトウェアや100X、1.45 NA、TIRFM油目標を利用しています。クロマフィルターセット（試薬を参照）：シリアルGFP、DAPI、Cy3で、Cy3.5およびCy5イメージングのため。 DAPIフィルタを使用細胞を見つけ、集中する。 基準点としてこれを設定してください。 総距離は0.2μMサイズ（25面）で5μMである基準点の周りの画像のzスタックを取る。各色素チャネル（ すなわち 、各プローブセット）について、この手順を繰り返します。 画像解析のための16ビットのTIFFとしてエクスポートします。 7。画像解析の概要（歌手プローブ） 以下我々はMATLABでFISH画像を分析するために使う計算手法の概要を提供します。使用され、関連するMATLAB関数は右側に囲まれている。アルゴリズムとしきい値は現在シンガースタイルのプローブからのデータのために調整されています。ステラリススタイルのプローブを使用すると、特に最後のフィルタリングステップ（7.8）にはいくつかの調整が必要となります。 セル識別15 DAPIの画像16上のグローバルしきい値を使用してバックグラウンドから別々のセル[graythresh]。 拡張された最大値関数[IMを使って核を識別extendedmax]。 流域アルゴリズムシードとして核を使用してセグメント細胞[分水嶺]。 各蛍光チャネルでスポットを検索背景を正規化し、信号対雑音比を向上させるためにトップハット変換を実行する[bwmorph]。 各スポットのために合焦層（z平面上の）を識別するための最大値を見つける[imregionalmax]。 放射状グラデーションの線形近似モデルを用いて、潜在的なスポットをフィルタリングします。 スポット強度とフィルタシングル対複数のプローブ信号を測定以前に同定された合焦層と推定強度17のスポットに2Dガウシアンプロファイルを合わせる。 しきい値（ヒストグラムに基づいて）を使用して、弱点を除外。歌手型プローブでは、これは重要ですが、ステラのプローブに少ないそうです。 各セル内のスポットを数える。