A Novel Hoge-resolutie<em> In vivo</em> Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie
Summary
We beschrijven een roman<em> In vivo</em> Beeldvormende techniek die koppels fluorescerende chimere muizen met intracraniële ramen en hoge-resolutie 2-foton microscopie. Dit imaging platform helpt studies van dynamische veranderingen in het hersenweefsel en microvasculatuur, op een single-cell niveau, na pathologische beledigingen en is aanpasbaar aan intracraniële drug delivery en distributie te beoordelen.
Abstract
We hebben met succes geïntegreerd eerder vastgestelde Intracranial venster (ICW) technologie 1-4 met intravitale 2-foton confocale microscopie een roman platform dat zorgt voor directe visualisatie op lange termijn van weefsel structuur verandert intracranially ontwikkelen. Imaging bij een enkele cel resolutie in een real-time mode biedt aanvullende dynamische informatie geven dan die welke door de standaard eindpunt histologische analyse, die uitsluitend wordt gekeken naar 'snap-shot' dwarsdoorsneden van weefsel.
Oprichting van deze intravitale beeldvormende techniek in fluorescerende chimere muizen, zijn we in staat om het vier fluorescente kanalen tegelijk. Door het opnemen van fluorescent gelabelde cellen zoals GFP + beenmerg, is het mogelijk om het lot van deze cellen studie op lange termijn migratie, differentiatie en integratie in weefsel te volgen. Verdere integratie van een secundaire reporter cel, zoals een mCherry glioom tumor lijn, zorgt voor kenmerkenterization van cel: cel interacties. Structurele veranderingen in het weefsel micro kunnen worden gemarkeerd door de toevoeging van intra-vitale kleurstoffen en antilichamen, bijvoorbeeld antilichamen en CD31 gelabeld dextran moleculen.
Bovendien beschrijven we de combinatie van onze ICW beeldvorming model met een klein dier micro-bestraler dat stereotactische bestraling geeft, het creëren van een platform via welke de dynamische veranderingen weefsel die optreden na toediening van ioniserende straling kan worden beoordeeld.
Huidige beperkingen van ons model zijn penetrantie van de microscoop, die beperkt is tot een diepte van 900 urn vanaf de sub corticale oppervlak, weergave beperkend voor de dorsale as van de hersenen. De aanwezigheid van het schedelbot maakt de ICW een uitdagende technische procedure in vergelijking met de meer gevestigde en benut kamermodellen momenteel gebruikt borstweefsel en vetkussentjes 5-7 bestuderen. Bovendien, de ICW provides veel uitdagingen bij het optimaliseren van de beeldvorming.
Introduction
Een beter begrip van de structurele en biologische veranderingen die naar aanleiding van verschillende pathologieën ontstaan in de hersenen en therapeutische interventies is essentieel voor het verbeteren behandelingsstrategieën. Een van de uitdagingen op het bestuderen van deze structurele en biologische veranderingen, met name wat de intracraniële pathologieën, is de ontoegankelijkheid van weefsel en het onvermogen om de temporele evolutie en dynamisch verloop van veranderingen in een in vivo omgeving te bestuderen. De opwekking van het "venster" technologie eerder succesvol gebleken bij de behandeling zachte weefsel veranderingen door tumorontwikkeling 5-7. Ontwikkeling van ICW modellen blijkt een grotere technische uitdaging vanwege de noodzaak om het schedelbot zonder beschadiging op aanzetten infectie in de onderliggende cerebrale weefsel. Vorige kranten hebben geprobeerd om de schedel aan het weefsel 8-10 visualiseren echter dun, in een hoge resolutie duidelijk im producerenleeftijden volledige verwijdering van de schedel bot is vereist 11. Herhaal lange termijn imaging (30 dagen +) is pas sinds kort een haalbare optie door beeldvorming 1,11 geworden, hebben eerder kortere frames bestudeerd 5.
In het afgelopen decennium een belangrijk doel is om de herkomst van neovasculatuur volgende pathologische stimuli toe te lichten, in het bijzonder wanneer tumorvorming en progressie van nieuwe therapeutische doelwitten voor de behandeling van tumoren bieden. Veel controverse blijft rond de bron van nieuwe bloedvaten in de hersenen tijdens tumorontwikkeling of na bestraling. Traditioneel vascularisatie wordt geacht plaats te vinden door middel van angiogenese, een proces waardoor nieuwe vaartuigen vormen de kiemen of reeds bestaande schepen 12. Meer recente studies suggereren echter dat de eerder aangenomen embryonale vasculogenese proces een belangrijke rol kan spelen in de vorming van pathologische vasculatuur. Vasculogenesis omvat de werving van de volwassen angioblast tegenhangers uit het beenmerg, die op hun beurt worden vervolgens direct betrokken bij de vorming van het nieuwe schip endotheel 12-14. Accumuleren bewijsmateriaal wijst erop dat endotheliale voorlopercellen worden gemobiliseerd uit het beenmerg naar de novo bloedvatvorming in reactie op oncogene bemiddelaars 15-17 initiëren. Echter, deze studies tegenstrijdig bewijs voor de rechtstreekse bijdrage van deze beenmerg afgeleide cellen (BMDCs) naar vat endotheel met procentuele bijdrage varieert met het type pathologische stimulus en de respons op de behandeling 18-21.
Daarom vaststelling reproduceerbare experimentele methoden die hoge-resolutie intravital imaging zorgen voor herhaalde langdurige studie van het proces van integratie in BMDC tumorvasculatuur en respons op therapie onschatbare waarde. Standaard histologische technieken niet aan de dynamische informatie verstrekkenvereiste informatie de lange-termijn overleving, differentiatie en integratie van de cellen die tot neovasculatuur en derhalve niet definitief aantonen van de mechanismen van cel interactie bepalen.
We hebben aangetoond in onze experimentele benadering dat er een verschillende mate van BMDC recruitment zowel na intracraniale ioniserende straling en tumorgroei, een recruitment dat echter is, pathologie plaatsgebonden en geen invasie van het gehele weefsel intracraniale 11,22. We hebben aangetoond dat de werving volgt een tijdgevoelige patroon blijkt uit het repeterend afbeelden van een enkel dier 11,22. Ook in vivo beeldvorming kan ook waardevolle inzichten in tumorcellen mimicry waarbij fluorescent gelabeld tumorcellen kunnen worden afgebeeld en gevolgd met een intra-vitale CD31 antilichaam voor endotheelcellen de mogelijkheid tumorcel transdifferentiatie rechtstreeks vormen eigen endotheel markeren.
<pclass = "jove_content"> De veelzijdigheid van het model wordt versterkt door het vermogen om fluorescent beeld 4 kanalen, een exhaustieve aantal combinaties voor de studie van verschillende cellulaire en biologisch proces. Wij zijn in staat om intravitally afbeelding GVB (blauw), GFP (groen), Cherry / RFP (rood), en Alexa647/APC (ver-rood), tegelijkertijd in een enkel veld herhaaldelijk in de tijd. Onderzoekers kunnen genetisch modificeren cellen fluorochromen voor elk van de kanalen en aankoop kleurstoffen en antilichamen uit naar structurele veranderingen van bijzonder belang te benadrukken. Tot op heden kleurstoffen en antilichamen gebruikt in studies omvatten CD31 en dextran die zowel highlight microvasculature en veranderingen in weefsel 1,11,23,24, hoewel we gebruik gemaakt van de ver-rode kanaal hiervoor beide beschikbaar voor gebruik in de andere kanalen genoemd. Zo hebben andere kleurstoffen zoals Sytox Orange, die gebieden blootleggen van apoptose en markers zoals die van het bedrijf Visen, spe geweestciaal ontworpen voor gebruik in vivo. Naar aanleiding van de vier meest gebruikte fluorescerende genoemde kanalen, kan een tweede harmonische generatie (SHG) kanaal worden toegevoegd en geoptimaliseerd om het imago van de endogene collageenvezels van het model 7, het visualiseren van de kelder membraan rond vaatstelsel.Het aanpassingsvermogen van ons model, evenals de bovengenoemde cel-cel interacties aan te tonen, hebben we in staat om drugs-cel interacties te bestuderen geweest. We hebben gekeken naar drug-remmers zoals AMD3100, een SDF-1-remmer, en haar rol in de signalering netwerken die betrokken zijn bij de werving BMDC 11. Op dezelfde manier hebben we genetisch gemanipuleerde uit U87 glioma xenografts cellen om VEGFTrap, een VEGF-remmer 25, uitdrukken in samenhang via een IRES een GFP-molecuul. Door RFP + BM kunnen wij de rol VEGF op de rekrutering van BMDCs de vasculatuur bestuderen. Meest recent hebben we het model om drug kinetiek studeren benut kijken naar de mechanism achter de tumor-afbakenen drug Fluorescein 26, op cellulair niveau. Door het gebruik van een speciaal gebouwd in het huis kleine dieren stralingapparaat we kunnen stereotactische geleverde straling te integreren om de respons van zowel tumor en BMDCs de behandeling te beoordelen zijn.
Door het gebruik van onze nieuwe intravitale beeldvormende methode onderzoekers inzicht te krijgen in het eencellige real-time veranderingen die optreden in de verschillende pathologieën en systemen, medeplichtigheid aan de opheldering van de vele functionele en biologische eigenschappen van het weefsel verandert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De drie kanalen in alle beelden tot dusver beschreven zijn uitwisselbaar voor drie markers van interesse in andere modellen en bladeren onderzoekers met een onschatbare set van tools om een groot aantal soorten en interacties cel opzoeken. Planning is nodig om ervoor te zorgen alle markeringen en celtypen hebben met succes geïntegreerd een verslaggever fluorescentie-molecuul in een aparte kanaal.
Naast de standaard drie kanalen die hier gebruikt maar er is ook een vierde integreren CFP kanaal (Figuur 4A) en een SHG collageen gebaseerde kanaal 7 (figuur 4B). Hierdoor wordt de mogelijkheid die cellulaire interacties in vivo en bovendien kan de gebruiker om de bevolking te mengen om specifieke cel-cel interacties te bestuderen, met behoud van twee kanalen voor andere markers te ondernemen. Zo hebben we gekeken naar tumorcellen (RFP) en kankerstamcellen (GVB) in een verhouding van 1:03 met een interesse in het vergelijken van hun intratummondelinge interacties (figuur 4A). We zagen dat 7 dagen na implantatie van de gemengde bevolking is de verhouding gehandhaafd en beide celpopulaties nog te zien.
De GVB-kanaal levert technische problemen te wijten aan de overlap met het GFP-kanaal in zowel excitatie en emissie spectra en als zodanig vereist bericht imaging processing om de ware GVB definiëren + cellen van de eigenlijk zijn GFP +. Bericht beeldvorming verwerking kan worden uitgevoerd op de 2-foton microscopen gebouwd in Zeiss LSM software direct waarbij, wordt de afbeelding van het GFP afgetrokken van het GVB beeld, wat resulteert in de echte GVB cellen achter (figuur 4A) wordt overgelaten. Het uitgangspunt voor de verhouding aftrekken is afhankelijk van even helder beeld en is te wijten aan het GVB laser (458 nm) fluoresceren zowel GVB en GFP-cellen, terwijl het GFP-laser (488 nm) is te hoog om het GVB cellen fluoresceren. Naast CFP hebben we kunnen eerder gepubliceerde setups om te kijken naar de SHG geweestniveau en dus tonen de collageenvezels waaruit de kelder membraan rond vasculatuur (figuur 4B).
Een andere aanpassing van het model gebruik gemaakt van een hypermoderne kleine dieren stralingapparaat dat de mogelijkheid stereotactische geleide straling om secties van weefsel bestralen van slechts 2 mm in diameter heeft. Door het richten raam met bestraling is het mogelijk om te kijken naar het effect straling op het onderliggende weefsel. We hebben onlangs een studie gepubliceerd te kijken naar het effect straling heeft op de normale hersenweefsel met betrekking tot de werving van BMDCs aan het vaatstelsel, specifiek kijken naar hun rol in de straling weefsel verandert. We vonden dat de werving van de BMDCs was zowel tijd-en dosis-afhankelijke in normaal weefsel 11.
Het is haalbaar om de mechanismen van levering en integratie van geneesmiddelen die het onderzoeksgeneesmiddel wordt gelabeld met een fluorescerende marker. Gedurendeons onderzoek we de productie van VEGFTrap, een anti-angiogene geneesmiddel dat alle VEGF signalering blokkeert in de omgeving van de productie 25 volgen zijn. Door het genetisch modificeren van onze tumorcellen aan de VEGFtrap gen gekoppeld aan een IRES om EGFP (figuur 4Ci) uiten en met RFP 'donor' BM waren we in staat om het imago van de EGFP: VEGFtrap productie, BMDC interactie en vaatstelsel tegelijkertijd (figuur 4Cii). Dit toonde de veelzijdigheid van het model en kanalen. Het is ook mogelijk om te kijken naar kinetiek van het geneesmiddel door de belofte van eencellige resolutie. Fluoresceïne (GFP +) wordt gebruikt om tumoren bakenen tijdens chirurgie te zorgen maximale resectie bereikt 26. Door injectie intraveneus tijdens beeldvorming is het mogelijk aan te tonen dat de afbakening gebeurt niet via de actieve opname van fluoresceïne in de tumorcellen zelf, maar door het verzamelen van het geneesmiddel in de stromale met time, gezien het gebrek aan co-localisatie 10 min na de injectie van fluoresceïne (Figuur 4D).
Kortom onze strategie combineert nieuwe en bestaande technieken om een uniek experimenteel platform, hetgeen voordelig is in de studie van dynamische cellulaire interacties bereiken. Deze strategie heeft zich bewezen als een waardevolle aanpak voor de behandeling van hoge-resolutie eencellige dynamische evolutie van BMDC, tumor en normale hersenen vasculariteit in reactie op de behandeling, intracraniaal zijn. Intravitale beeldvorming kan zorgen voor een beter begrip van de moleculaire regulatoren van BMDC werving, migratie en differentiatie in intracraniale hersentumor vaatstelsel evenals vele andere dynamische processen aan te passen aan andere onderzoeksgebieden. Vermoedelijke remmende factoren die BMDC regelen in combinatie met andere therapeutische strategieën kunnen de beschrijving van de exacte timing van combinatorische therapieën helpen. Bovendien kan deze strategie aangepast worden aan toekomstige projecten gebruik niet alleen in vivo intravitale vlekken kleurstoffen, maar ook kleine moleculaire remmers en nanodeeltjes die fluorescent zijn gelabeld waardoor onderzoekers de verspreiding en migratiepatronen van meer gerichte therapieën te sporen evenals lengterichting kijken naar hun kinetiek.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de Advanced Optical Microscopie Facility dank aan de prinses Margaret ziekenhuis, met name James Jonkman voor hun hulp bij de eerste installatie van de kanalen op de 2Photon microscoop. De auteurs willen graag de tijdruimtelijke Targeting en versterking van de Straling Response (STTARR) programma en haar gelieerde financiers erkennen. Wij danken dr. Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael en Dr.Andras Nagy voor het leveren van de VEGFTrap plasmiden en voor hun manuscript correcties en feedback. De voortdurende steun en bespreking van het personeel bij de BTRC is van onschatbare waarde geweest en we zouden graag Dr.Abhijit Guha Herdenken voor zijn wetenschappelijke inbreng. Werk werd gefinancierd door CIHR en NIH subsidies.
Materials
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |
References
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -. E., Lu, S. -. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -. r. Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. 癌症研究. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. . Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
